外源甜菜堿處理對干旱脅迫下半夏氮代謝及相關(guān)酶活性的影響

張紅敏，李姣姣，黑剛剛，曹瑞霞，周心渝，李琳琳，楊衛(wèi)星，吳能表

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715）

半夏（Pinelliaternata）為天南星科半夏屬多年生草本植物，是一種常見的中藥材，以塊莖入藥，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)的功效［1］。半夏根較淺，喜溫和濕潤氣候，半夏受干旱、洪澇、高溫和強(qiáng)光等環(huán)境因素影響較多，從而影響到半夏的生命活力，致使半夏發(fā)生嚴(yán)重的非生理性倒苗，導(dǎo)致半夏的減產(chǎn)和塊莖品質(zhì)的下降，其主要成分總生物堿、腺苷、鳥苷、半夏蛋白、揮發(fā)油及無機(jī)元素等多種化學(xué)成分含量也會受到影響。

甜菜堿屬于季銨型水溶性生物堿，是一種生理抗旱（鹽）劑，通過生理調(diào)節(jié)作用減緩由于干旱／鹽脅迫對植物造成的傷害，以達(dá)到提高植物耐旱（鹽）性的目的，對植物維持呼吸作用和光合作用的正常進(jìn)行也具有重要的生理意義［2］。外源甜菜堿的抗旱生理作用研究也取得了一定進(jìn)展，目前有研究報(bào)道，甜菜堿可以有效地緩解干旱引起的小麥（Triticumaestivum）旗葉的氣孔和非氣孔限制，提高氣孔導(dǎo)度和羧化效率［3］；減緩脅迫對植物體內(nèi)1，5－二磷酸核酮糖羧化／加氧酶（Rubisco）活性的影響［4］。對煙草（Nicotianatabacum）品種大黃金5210（抗旱性強(qiáng)）和中煙100（抗旱性弱）進(jìn)行根施甜菜堿，發(fā)現(xiàn)外源甜菜堿處理減輕了水分脅迫對葉綠素含量、PSⅡ光化學(xué)效率、希爾反應(yīng)活力以及類囊體膜ATPase活性降低程度［5］。

目前的研究主要集中在甜菜堿對逆境脅迫下植物的滲透調(diào)節(jié)及相關(guān)生理特性的影響上，而對其次生代謝產(chǎn)物及氮代謝過程的影響卻鮮有報(bào)道。本研究以野生半夏為材料，通過噴灑不同濃度的甜菜堿溶液來研究干旱脅迫下半夏體內(nèi)氮代謝過程中關(guān)鍵酶活性及總生物堿、鳥苷和腺苷等的藥用成分的影響，以期探討提高半夏抵御干旱脅迫下次生代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制，并為甜菜堿能有效提高干旱脅迫下半夏有效成分及緩解干旱脅迫傷害提供理論參考。

1 材料與方法

1．1 植物的栽培與處理

半夏塊莖購于重慶市北碚區(qū)明家溝，經(jīng)西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院吳能表教授鑒定為天南星科植物半夏塊莖，2012年6月種于西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院苗圃中。

2012年7月待半夏長成至12cm高左右時(shí)，選取長勢一致、葉型相同的半夏移栽于盛有充分混勻的介質(zhì)（壤土∶珍珠巖＝3∶1）的黑色營養(yǎng)袋（25cm×20cm）中，每盆10棵，恢復(fù)生長后對其進(jìn)行干旱處理，干旱通過自然干旱和稱重法來進(jìn)行控制，干旱程度通過土壤相對含水量（土壤相對含水量＝土壤含水量／土壤飽和含水量×100%）來確定，CK為對照組，土壤含水量保持在75%±2%左右，D組為重度干旱，土壤含水量為35%±2%左右，D20組為噴施了20mmol／L的甜菜堿溶液的干旱組，D40組為噴施了40mmol／L的甜菜堿溶液的干旱組，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。在干旱處理的第0，9，18，27天上午10時(shí)左右采樣，每個(gè)處理組隨機(jī)采樣10株，3次重復(fù)，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測定。

1．2 測定方法

1．2．1 谷氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶及谷氨酸脫氫酶活性的測定 谷氨酸合成酶（GOGAT，glutamate synthase）活性的測定參照趙全志等［6］的方法，略有改動，精密稱取0．3g半夏葉片剪碎后放于研缽中加2mL 50 mmol／L的pH 8．0的 Tris－HCl緩沖液［含2mmol／L MgSO4、0．5mmol／L EDTA（乙二胺四乙酸，ethylene diamine tetraacetic acid）、10mmol／Lβ－巰基乙醇］冰浴研磨后放入離心管中，4℃下10000r／min離心30min，上清液即為酶提取液。酶活力用μmol NADH／（g FW·min）為單位。

谷氨酰胺合成酶（GS，glutamine synthetase）活性測定參照湯章城［7］的方法。

谷氨酸脫氫酶（GDH，glutamic dehydrogenation enzyme）的活性測定參照 Majerowicz等［8］的方法，略有改動，改動處同GOGAT的酶提取液方法。

1．2．2 硝態(tài)氮、蛋白質(zhì)的測定 硝態(tài)氮、可溶性蛋白質(zhì)含量的測定參照李合生［9］的方法。

1．2．3 總生物堿含量的測定 稱取半夏塊莖于60℃下烘干磨碎后過60目篩，其粉末用于總生物堿測定，測定方法參照于超等［10］的紫外分光光度計(jì)法?？偵飰A含量用mg／g為單位。

1．2．4 鳥苷和腺苷的測定 色譜條件：參照張敏等［11］的方法略有改動，Xtimate C18色譜柱（4．60mm×250 mm，5μm），甲醇∶水＝15∶85為流動相，流速為1．0mL／min，檢測波長為254nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL。

樣品制備：取半夏塊莖于60℃烘干至恒重，研碎后過60目篩，取各處理組樣品粉末0．3g加入30%甲醇3 mL后稱重，超聲提取30min，再用30%甲醇補(bǔ)足重量后于5000r／min離心10min，提取上清液后過0．22μm微孔濾膜后備用。鳥苷和腺苷含量用μg／g為單位。鳥苷、腺苷標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜圖見圖1。

圖1 半夏混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖和樣品色譜圖Fig．1 P．ternatachromatogram of mixed standard and sample chromatograms

圖2 甜菜堿對干旱脅迫下半夏葉片內(nèi)谷氨酸合成酶活性的影響Fig．2 Effects of different concentrations of betaine treatments on GOGAT activity of P．ternatain drought stress

1．3 數(shù)據(jù)處理

所有指標(biāo)均重復(fù)測定3次，數(shù)據(jù)采用SPSS 11．5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和方差檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2．1 甜菜堿處理對干旱脅迫下半夏氮代謝相關(guān)酶活性的影響

2．1．1 甜菜堿處理對干旱脅迫下半夏葉片中GOGAT活性的影響 GOGAT是氮素同化過程中的關(guān)鍵酶，GS／GOGAT偶聯(lián)形成的是高等植物氨同化的主要途徑，在無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮的過程中起關(guān)鍵作用［12－13］。由圖2可知，隨著處理時(shí)間延長，D40、D20和D組的GOGAT活性呈明顯下降趨勢，而CK組則下降不明顯。在處理第9天，CK組與其他3組之間差異達(dá)顯著水平，D20、D40之間差異不顯著，兩組分別比D組活性提高了15．6%和14．0%。處理第18天，各組之間差異顯著，CK組顯著高于其他3組，D20、D40與D組相比活性分別提高14．6%和28．3%。在處理第27天，D20、D組之間差異不顯著，D40與D組相比活性提高36．0%。由此可知，干旱對GOGAT活性有明顯影響，但噴施外源甜菜堿溶液能緩解酶活性的降低，處理組活性明顯高于干旱組，同時(shí)也加快了氮素的同化。

2．1．2 甜菜堿處理對干旱脅迫下半夏葉片中GS活性的影響 谷氨酰胺合成酶（GS）是催化谷氨酰胺與α－酮戊二酸形成谷氨酸的酶，NH4＋－N的同化主要通過谷氨酰胺合成酶（GS）／谷氨酸合成酶（GOGAT）循環(huán)途徑，所以GS的活性大小直接影響銨的代謝速度［14］。

隨著干旱脅迫時(shí)間的增加，各組的GS活性呈下降趨勢，CK組下降較緩慢，其活性均大于其他3組。在處理的第9天，D20、D40與D組相比，活性分別提高了11．1%和5．1%，各組之間差異達(dá)顯著水平。在處理的第18天，D20、D40與D組相比，活性分別提高了7．8%和12．3%。在處理的第27天，D20、D40較D組活性分別提高了9．6%和17．8%，各組之間具有顯著性差異（圖3）。由此可知，GS活性表現(xiàn)為D40＞D20＞D，較高的GS活性加快了銨代謝，從而有利于積累次生代謝產(chǎn)物。

2．1．3 甜菜堿處理對干旱脅迫下半夏葉片中GDH活性的影響 GDH在NH4＋的合成及Glu的代謝中具有十分獨(dú)特的作用。它在NH4＋的合成和再合成中起初始性作用，并在Glu合成循環(huán)中起補(bǔ)充作用，但是它在高等植物中的生理作用仍有爭議［15］。由圖4可知，D、D20和D40這3組在干旱脅迫條件下GDH活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在第9天達(dá)到最大值。CK組第9天升高，第18～27天期間變化不明顯。在處理的第9天，D20活性最高，與CK、D、D40相比，GDH活性分別提高了24．9%，49．4%和11．7%，各組之間差異顯著。在處理的第18天，CK組活性值大于處理組，CK組與D20之間差異不顯著，D20、D40與D組相比，GDH活性分別提高了20．7%和15．8%。在處理的第27天，CK組活性仍然為最大，與其他3組之間存在顯著性差異，D20、D40較D組分別提高了15．6%和25．1%，D40略高于D208．2%，兩者差異不顯著。由此可知，在處理第9天噴施了20mmol／L的甜菜堿溶液的處理組GDH活性比D、D40高，而在后期，D20與D40組的活性差異不顯著。

2．2 甜菜堿處理對干旱脅迫下半夏中可溶性蛋白及硝態(tài)氮含量的影響

植物吸收的氮源經(jīng)一系列的還原與同化過程后形成游離氨基酸、可溶性蛋白等有機(jī)含氮化合物，供植物吸收與利用［16］，在干旱脅迫的后期，可溶性蛋白作為一種調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與了維持細(xì)胞較低的滲透勢，抵抗干旱脅迫所導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。由表1可知，干旱脅迫下，隨著時(shí)間增加，各個(gè)組可溶性蛋白含量呈先升高后降低的趨勢，CK組后期可溶性蛋白質(zhì)含量降低較緩慢。CK、D40和D20均在第9天達(dá)到最大值，D組在第18天達(dá)到最大值。噴施了甜菜堿溶液的處理組蛋白質(zhì)含量均高于沒有噴施的干旱處理組。其中，在處理第9天，D40和D20比D組分別提高了9．5%和6．0%，與D組差異達(dá)顯著水平，D40與CK組之間差異不顯著，與D20之間具有顯著性差異。在處理的第18，27天，D40與D組相比分別提高了0．7%和7．3%，另外又比D20提高了6．8%和3．1%。由此可知，40 mmol／L的甜菜堿溶液提高了干旱脅迫下半夏的可溶性蛋白含量，可溶性蛋白參與調(diào)解滲透勢，用以抵抗干旱脅迫，提高了其抗逆性，降低了逆境對半夏的傷害。

圖3 甜菜堿對干旱脅迫下半夏葉片內(nèi)谷氨酰胺合成酶活性的影響Fig．3 Effects of different concentrations of betaine treatments on GS activity of P．ternatain drought stress

圖4 甜菜堿對干旱脅迫下半夏葉片內(nèi)谷氨酸脫氫酶活性的影響Fig．4 Effects of different concentrations of betaine treatments on GDH activity of P．ternatain drought stress

表1 不同濃度甜菜堿處理對半夏蛋白質(zhì)含量的影響Table 1 Effects of different concentrations of betaine treatment on protein content of P．ternata μg／g

干旱脅迫影響植物對氮的吸收和利用，造成植物體細(xì)胞內(nèi)氮素代謝的紊亂，GS活性的降低造成了硝態(tài)氮積累，20mmol／L的甜菜堿溶液降低了半夏體內(nèi)的硝態(tài)氮含量，提高了對氮素的利用。由表2可知，隨著時(shí)間的增加，在處理期間各組硝態(tài)氮含量呈上升趨勢，且D組含量均高于其他3個(gè)組，具有顯著性差異。在處理的第9天，D組含量分別高于CK組、D20和D4022．4%，8．1%和11．1%，D組與D20差異不顯著。在處理第18天，D20和D40差異不顯著，在處理第27天，D組含量分別高于其他3個(gè)組21．8%，10．2%和5．2%，各組之間具有顯著性差異。由此可知，干旱刺激了植物體內(nèi)硝態(tài)氮的產(chǎn)生。

2．3 甜菜堿處理對干旱脅迫下半夏塊莖中生物堿的影響

由表3可知，CK、D、D20、D40四個(gè)組總生物堿含量都隨處理時(shí)間延長呈上升趨勢，D、D20、D40三個(gè)組在處理期間的總生物堿含量均低于CK組。其中，在整個(gè)處理期間D組與CK、D20、D40具有顯著性差異，增長率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他組。在處理第9，18，27天時(shí)，D40與D組相比，總生物堿含量分別提高了34．2%，48．8%和23．7%，D20較D組總生物堿含量分別提高了26．3%，34．9%和10．2%，在第9天時(shí)，D40與CK組之間的差異不顯著，在第18天時(shí)，D40、D20與CK組具有顯著差異。在第27天時(shí)，D40與CK組差異不顯著。隨著干旱時(shí)間的延長，40mmol／L的甜菜堿溶液顯著提高了干旱脅迫下半夏總生物堿的含量，D、D20、D40的含量高低與GS、GOGAT活性變化趨勢相一致，說明這兩種酶的活性可能影響了總生物堿的合成。

2．4 甜菜堿處理對干旱脅迫下半夏塊莖中鳥苷及腺苷含量的影響

由表4可知，各組的鳥苷含量總體都呈上升趨勢，D、D20、D40三個(gè)組在處理期間的鳥苷含量均低于CK組，D組與其他3組之間具有顯著性差異。在處理的第9天，D20、D40與D相比，分別提高了33．6%和15．3%。在處理的第18天，D20、D40較D組相比，分別提高了43．5%和74．3%，具有顯著性差異。在處理的第27天，D20、D40較D組相比，分別提高了50．9%和87．6%，具有顯著性差異。

表2 不同濃度甜菜堿處理對半夏硝態(tài)氮含量的影響Table 2 Effects of different concentrations of betaine treatment on nitrate content of P．ternata μg／g

表3 不同濃度甜菜堿處理對半夏總生物堿含量的影響Table 3 Effects of different concentrations of betaine treatment on total alkaloid content of P．ternata mg／g

表4 不同濃度甜菜堿處理對半夏鳥苷及腺苷含量的影響Table 4 Effects of different concentrations of betaine treatment on guanosine and adenosine content of P．ternata μg／g

由表4可知，隨著時(shí)間的增加，各組的腺苷含量總體呈先上升后降低的趨勢，除D40在第27天達(dá)到最大值外，其余組均在第18天左右達(dá)到最大值，CK組含量均大于其他組。在第9天時(shí)，D20、D40與D組相比分別提高了13．0%和21．8%，兩組與CK組之間差異不顯著。在第18天時(shí)，D20、D40與D組相比，分別提高了67．2%和46．0%，D20與CK組之間差異不顯著，與D40之間差異達(dá)顯著水平。在第27天時(shí)，D20、D40與D組相比，分別提高了43．2%和56．3%，D40與CK組之間差異不顯著。由此可知，噴施了外源甜菜堿能促進(jìn)干旱脅迫下半夏鳥苷和腺苷的積累，其中，鳥苷和腺苷含量均表現(xiàn)為D40＞D。

3 討論

干旱是植物生存環(huán)境中的主要逆境因子之一，主要影響植物各項(xiàng)生理指標(biāo)的變化及體內(nèi)有機(jī)物的積累，從而致使植物停止生長和發(fā)育，最終植物個(gè)體或群體生長受抑制，形態(tài)發(fā)生變化，生物量或產(chǎn)量受到影響［17－19］。水分脅迫也嚴(yán)重制約著半夏的生長發(fā)育［20］，易導(dǎo)致半夏的非生理性倒苗，對半夏中的藥用成分的積累也產(chǎn)生了一定影響。有研究報(bào)道指出，甜菜堿在調(diào)節(jié)植物對環(huán)境脅迫的適應(yīng)性，提高植物對各種脅迫因子抗性等方面具有重要的生理作用［21］，如水分脅迫下，外源甜菜堿能明顯減緩柑橘（Citrusreticulata）干物質(zhì)的流失，提高柑橘的抗旱性［22］，噴施0．5mmol／L的甜菜堿溶液能緩解玉米（Zeamays）幼苗的水分脅迫，提高幼苗的生物量、葉片相對含水量、根冠比及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化酶活性、ABA含量［23］，葉面噴施甜菜堿增強(qiáng)了桃樹（Prunuspersica）的抗旱性，減緩了水分脅迫對樹體的傷害［24］。

在干旱脅迫下，噴施了外源甜菜堿的處理組總生物堿、鳥苷和腺苷含量均高于沒有噴施甜菜堿的干旱處理組，這可能與外源甜菜堿提高了氮代謝過程中關(guān)鍵酶的活性有關(guān)。隨著干旱脅迫時(shí)間的增加，GS、GOGAT活性逐漸降低，植物中氮素吸收主要依靠GS／GOGAT循環(huán)，因此氮素的同化受到影響，而這一循環(huán)產(chǎn)生的谷氨酰胺和谷氨酸是植物體內(nèi)合成氨基酸、核酸、多胺和葉綠素等含氮有機(jī)物的前體物質(zhì)［25］。由GS／GOGAT循環(huán)產(chǎn)生的谷氨酰胺與天冬氨酸和其他物質(zhì)結(jié)合形成次黃嘌呤，并進(jìn)一步合成鳥苷及腺苷，因此GS和GOGAT活性的升高能有效增加鳥苷和腺苷的前體物的積累。谷氨酸脫氫酶（GDH）在氨的再同化中起重要作用［26］，它主要是催化谷氨酸＋NADP→α－酮戊二酸＋NADPH＋NH4＋。據(jù)推測GDH可能作為GS在不利情況下活性降低的一種補(bǔ)償，催化谷氨酸脫氨產(chǎn)生的2－酮戊二酸向三羧酸循環(huán)提供碳骨架，以穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)［27］。另外GS、GOGAT活性的降低使NH4＋同化受阻，造成葉片中NH4＋的累積［28］，致使在后期生長中GDH活性降低，硝態(tài)氮含量升高，嚴(yán)重影響了半夏對氮素的利用，而噴施了甜菜堿溶液的兩處理組硝態(tài)氮含量上升幅度均小于未噴施的干旱組，減輕了因NH4＋積累而造成的光合速率下降，提高半夏的抗旱性，降低硝態(tài)氮含量，加快氮素的同化。本實(shí)驗(yàn)表明，40mmol／L的外源甜菜堿溶液能較好的減緩GS、GOGAT活性的降低，提高GDH活性，清除NH4＋的積累，加速氮素的同化，提高氮代謝水平，為生物堿、鳥苷、腺苷的合成提供更多的前體物質(zhì)，從而有利于次生代謝產(chǎn)物的積累。

氮代謝狀況與植物抗旱性強(qiáng)弱也存在一定的聯(lián)系，高水平的氮素代謝也可以提高植物的抗旱性。植物體內(nèi)的可溶性蛋白含量是反映植物體總代謝水平的一個(gè)重要指標(biāo)，半夏葉片中可溶性蛋白含量隨著干旱的時(shí)間呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在干旱脅迫初期，可溶性蛋白含量增加，它作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與維持調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，起到了抵御干旱脅迫的作用。在干旱脅迫后期，蛋白酶等一系列水解酶活性增加，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分解，因此含量開始減少。噴施了甜菜堿溶液的兩處理組可溶性蛋白含量均高于未噴施的干旱組，所以較D組而言，噴施了甜菜堿的兩干旱處理組抗逆性都有所增強(qiáng)，并且其倒苗時(shí)間均晚于D組。

綜上所述，氮代謝失調(diào)是半夏受到干旱脅迫的重要表現(xiàn)之一，對干旱脅迫下的半夏噴施40mmol／L的外源甜菜堿溶液，能有效提高氮素同化過程中的關(guān)鍵酶（GS、GOGAT、GDH）活性，通過增加前提物質(zhì)含量從而促進(jìn)總生物堿、鳥苷、腺苷含量的積累，提高了半夏塊莖中的有效成分含量。同時(shí)外源甜菜堿有利于提高植物葉片水勢、膨壓和相對含水量［29］，另外滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性蛋白質(zhì)）含量的增加，不但提高了葉片滲透調(diào)節(jié)能力而且在植物體合成有機(jī)物的碳源和氮源等方面也發(fā)揮了重要作用［30］，因此葉面噴施甜菜堿有助于提高半夏抗旱性，延緩半夏的非生理性倒苗期，為實(shí)際生產(chǎn)中緩解半夏干旱脅迫及有效成分的積累提供理論依據(jù)。

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