甘肅省紫花苜蓿種帶促生多粘類芽孢桿菌的分離與鑒定

張振粉，南志標(biāo)

（草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州730020）

多粘類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa）原屬于多粘芽孢桿菌（Bacilluspolymyxa），Ash等［1］于1993年將其新歸于類芽孢桿菌屬。多粘類芽孢桿菌是一種植物非致病性產(chǎn)橢圓形芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌，可以從土壤、小麥（Triticumaestivum）和牧草根際中分離得到［1］。多粘類芽孢桿菌是一種功能性極強(qiáng)的微生物，具有分泌植物激素（如細(xì)胞分裂素、吲哚乙酸等）和提供氮素等特性，促進(jìn)植物生長［2－5］；Zhao等［6］從黃瓜（Cucumissativus）根際土壤中分離的多粘類芽孢桿菌BMP－11菌株提取了可以抗真菌，抗蟲和除草活性的揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)；Lai等［7］研究發(fā)現(xiàn)，從越南槐（Sophoratonkinensis）分離得到的多粘類芽孢桿菌SG－6菌株同樣具有防止柑橘（Citrusreticulata）采后發(fā)霉的作用；同時它還能產(chǎn)生肽類［8－9］、蛋白質(zhì)類［10］、核苷類［11］、吡嗪類［12］和酚類［2，13］等多種抗菌物質(zhì)，防治多種植物病害［14－19］。童蘊(yùn)慧等［20］將多粘類芽孢桿菌 W3、Y2菌株和地衣芽胞桿菌（Bacillus licheniformis）W10菌株接種致病番茄（Lycopersiconesculentum）后，誘導(dǎo)其植株對灰霉病菌（Botrytiscinerea）產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。此外，由于出色的固氮能力，多粘類芽孢桿菌還可被應(yīng)用于消除油菜（Brassicacampestris）體內(nèi)的有害硝酸鹽，從而提高油菜品質(zhì)［21］。多粘類芽孢桿菌是被美國環(huán)境保護(hù)署（EPA）列為可商業(yè)應(yīng)用的微生物種類之一，我國農(nóng)業(yè)部也將其列為免做安全鑒定的一級菌種，目前報道該菌可用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)和水處理等方面［22］。

紫花苜蓿（Medicagosativa）在我國已有2000多年的栽培歷史，是重要的多年生豆科牧草，以其產(chǎn)量高，具有保持水土和改善土壤結(jié)構(gòu)的功能，是北半球溫帶地區(qū)最主要的牧草、草田輪作的首選豆科牧草，在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中有著不可替代的作用［23－24］。李春杰和南志標(biāo)［25］系統(tǒng)研究了苜蓿種帶真菌的區(qū)系及其致病性。郭玉霞等［26］對黃土高原區(qū)苜蓿與小麥輪作系統(tǒng)根部入侵真菌進(jìn)行了詳細(xì)研究。有關(guān)紫花苜蓿種帶細(xì)菌區(qū)系的研究在國內(nèi)尚屬空白，本研究以甘肅省不同紫花苜蓿產(chǎn)地的種子為材料，分離其細(xì)菌區(qū)系，經(jīng)發(fā)芽試驗(yàn)篩選了一種促進(jìn)苜蓿生長的細(xì)菌。Biolog及生理生化分析確定該菌株屬于多粘類芽孢桿菌，紫花苜蓿種子發(fā)芽試驗(yàn)測定結(jié)果顯示該菌株具有促進(jìn)苜蓿苗生長的作用。該菌株的分離與鑒定對于探討甘肅省不同紫花苜蓿種植區(qū)有益菌多粘類芽孢桿菌的生態(tài)分布提供了理論基礎(chǔ)，并為紫花苜蓿在草地早期建植的應(yīng)用提供了新的菌種資源。

1 材料與方法

1．1 材料

1）種樣

供試種樣源自農(nóng)業(yè)部牧草與草坪草種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（蘭州）低溫種質(zhì)資源庫的13種不同產(chǎn)地和不同收獲年限的紫花苜蓿種子，每種各3份，共計39份（表1）。

表1 紫花苜蓿種子收獲年份和地點(diǎn)及其地理氣候信息Table 1 Harvest time and harvest location of M． sativa seed samples and their geographical and climatic information

2）培養(yǎng)基

分離、純化及活化分離物的培養(yǎng)基為肉汁胨培養(yǎng)基（NA）（蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂18g，蒸餾水1L，121℃下滅菌30min）和固氮能力測試所用培養(yǎng)基為阿須貝培養(yǎng)基（Ashby medium）（葡萄糖：10g，KH2PO40．2g，MgSO4·7H2O 0．2g，NaCl 0．2g，CaSO4·2H2O 0．2g，CaCO35．0g，蒸餾水1L，113℃下滅菌30min）［27］。

1．2 方法

1）細(xì)菌的分離

種子表面消毒分離：各產(chǎn)地紫花苜蓿種子稱取1g為樣品，經(jīng)75%乙醇2min和1%次氯酸鈉5min進(jìn)行表面消毒，繼之以無菌水沖洗4～5次［28］。將表面消毒后的苜蓿種子置于滅菌的研缽中研碎，轉(zhuǎn)移種子粉末至裝有100mL無菌蒸餾水的250mL的三角瓶中于恒溫?fù)u床25℃、100r／min震蕩5min，隨后取1mL懸浮液制成不同濃度梯度（10－1，10－2和10－3），每個梯度取200μL，轉(zhuǎn)置NA培養(yǎng)基中央涂抹，使之均勻地布滿整個培養(yǎng)基，重復(fù)3～4皿，（28±1）℃下培養(yǎng)3d。

種子發(fā)芽分離及沖洗分離：將紫花苜蓿種子樣品浸泡于100mL無菌蒸餾水的三角瓶（250mL）中，于恒溫?fù)u床25℃、150r／min震蕩10min，取1mL懸浮液制成不同濃度梯度（10－1，10－2和10－3），每梯度取200μL涂板，重復(fù)3～4皿，（28±1）℃下培養(yǎng)3d。

在上述培養(yǎng)平板上挑取相似細(xì)菌分離物單菌落，對其進(jìn)行編號，純化后在－80℃添加甘油的NA培養(yǎng)基中長期保存和4℃下NA培養(yǎng)基中短期保存。

2）Biolog鑒定

純化得到的8株細(xì)菌分離物HTBRC 1～8和購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心的多粘類芽孢桿菌模式菌株ACCC 10252于NA平板28℃活化培養(yǎng)24h后備用，按照Biolog自動快速微生物鑒定系統(tǒng)（Biolog Inc．，Hayward，CA）說明書操作。根據(jù)2006年的數(shù)據(jù)庫顯示，Biolog能鑒定革蘭氏陰性菌524種（106個屬）和革蘭氏陽性菌351種（55個屬）。此實(shí)驗(yàn)于2011年12月，在草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室草類病理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

3）表型鑒定

純化得到的8株細(xì)菌分離物 HTBRC 1～8和ACCC 10252菌株，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［29］和《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》［30］對其進(jìn)行菌體形態(tài)觀察并照相 （Biomicroscope Olympus BX51），革蘭氏染色反應(yīng)，鞭毛染色反應(yīng)以及厭氧生長試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、硝酸還原試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、V－P試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)和糖醇類發(fā)酵等生理生化指標(biāo)測定。

4）發(fā)芽試驗(yàn)

將NA平板28℃培養(yǎng)24h后的代表細(xì)菌分離物HTBRC1制成108cfu／mL菌懸液。取1g紫花苜蓿種子（阿爾岡金品種）浸泡于HTBRC1的懸浮液中5min后，設(shè)種子浸泡于無菌水為對照，取出后于無菌濾紙上自然晾干。將晾干的種子參照GB／T 2930．4－2001進(jìn)行發(fā)芽，4d后開始統(tǒng)計發(fā)芽率，測量根長和苗長，并觀察真菌侵染種子發(fā)芽現(xiàn)象。整個試驗(yàn)重復(fù)2次。

1．3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 13．0軟件進(jìn)行方差分析和顯著性測定，試驗(yàn)中的發(fā)芽率數(shù)據(jù)是經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換所得，方差分析采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2．1 細(xì)菌的分離

試驗(yàn)從13個不同苜蓿種子產(chǎn)地的8個中，分離得到在NA培養(yǎng)基上形成粉紅色，隆起，粘稠狀，具有很強(qiáng)的粘性，表面濕潤光滑邊緣整齊的細(xì)菌分離物（圖1A）；革蘭氏染色陽性，菌體桿狀，大小為0．5～2．5μm×1．2～10 μm（圖1B）。我們將這8個產(chǎn)地分離得到的代表性分離物進(jìn)行編號后備用，它們分別為HTBRC1、HTBRC2、HTBRC3、HTBRC4、HTBRC5、HTBRC6、HTBRC7和 HTBRC8（表2）。

圖1 細(xì)菌分離物HTBRC 1～8的形態(tài)特征Fig．1 The morphology characteristic of bacterial isolates HTBRC 1－8

2．2 Biolog鑒定

8株分離自苜蓿的細(xì)菌分離物HTBRC 1～8和在Biolog GP2鑒定板上培養(yǎng)4～6h時與Biolog數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果顯示為“NO ID”，培養(yǎng)20h時它們與Biolog數(shù)據(jù)庫中的多粘類芽孢桿菌相似度為0．533～0．880。根據(jù)Biolog自動快速微生物鑒定系統(tǒng)（Biolog Inc．，Hayward，CA）說明，相似度于菌株培養(yǎng)4～6h時≥0．75，鑒定結(jié)果可靠；相似度于菌株培養(yǎng)16～24h時≥0．5，鑒定結(jié)果可靠。表2結(jié)果顯示與培養(yǎng)20h時它們在Biolog數(shù)據(jù)庫中的多粘類芽孢桿菌相似度均大于0．5，說明結(jié)果可靠。因此，根據(jù)Biolog鑒定結(jié)果，HTBRC 1～8均初步鑒定為多粘類芽孢桿菌。

表2 紫花苜蓿種帶細(xì)菌分離物和ACCC 10252菌株來源及其Biolog鑒定結(jié)果Table 2 Source of M ． sativa seed－borne bacterial isolates and ACCC 10252strain and their results of Biolog identification

2．3 生理生化鑒定

8株分離自苜蓿的細(xì)菌分離物HTBRC 1～8和ACCC 10252菌株的生理生化指標(biāo)詳見表3。這8個細(xì)菌分離物與ACCC 10252菌株生理生化指標(biāo)基本相似，其最大的特點(diǎn)是較模式菌株具有更高的鹽耐受性和固氮能力，它們可在添加5%NaCl的NA平板上生長并在阿須貝無氮培養(yǎng)基連續(xù)生長3代以上。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［29］和《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》［30］初步鑒定 HTBRC 1～8為多粘類芽孢桿菌。

2．4 發(fā)芽試驗(yàn)

用代表菌株HTBRC1菌懸液浸種后，苜蓿種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢較未浸泡過的顯著增加，根長均具有顯著提高（P＜0．05），苗長有小幅增長，但差異不顯著（P＞0．05）（圖2）。此外，經(jīng)菌懸液浸泡過的種子在發(fā)芽過程中肉眼未見種帶致病真菌危害苜蓿芽的生長，相反未經(jīng)菌懸液浸泡過的種子在發(fā)芽過程中有真菌侵染現(xiàn)象。

3 討論

本研究首次于紫花苜蓿種子上分離得到多粘類芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)了該菌可于種子表面及內(nèi)部存活，新記錄了該菌的生境。這些紫花苜蓿種子分別是2002，2004，2006和2009年入庫的，來自位處河西走廊的臨澤，黃土高原的環(huán)縣和西峰等，以及青藏高原的瑪曲。由此可知，該菌可在紫花苜蓿種子上存活達(dá)10年之久，它在甘肅省不同紫花苜蓿種植區(qū)的分布與年降水量和年均溫沒有明顯的關(guān)系。該菌可以從土壤、小麥和牧草根際中分離得到［1］，因此它的分布可能與當(dāng)?shù)赝寥李愋突蚰敛菖c小麥等農(nóng)作物輪作，套作等方式相關(guān)。

圖2 多粘類芽孢桿菌浸種14d后的紫花苜蓿種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率（A）以及根長和苗長（B）Fig．2 Germination index and percent of seed germination（A）and shoot and root length（B）of lucerne seeds after soaked with P． polymyxa after 14d

本試驗(yàn)8個細(xì)菌分離物的生理生化鑒定與Biolog鑒定結(jié)果一致，初步鑒定HTBRC 1～8菌株均為多粘類芽孢桿菌。該試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了Biolog自動快速微生物鑒定系統(tǒng)相似度于菌株培養(yǎng)4～6h時≥0．75時或菌株培養(yǎng)16～24h時≥0．5時，鑒定結(jié)果可靠。表型鑒定進(jìn)一步驗(yàn)證了Biology鑒定的可靠性。Biolog技術(shù)因其數(shù)據(jù)庫容量大，種類齊全；鑒定結(jié)果準(zhǔn)確率高；鑒定周期短，最快4個小時出結(jié)果；操作簡單，對操作者技術(shù)要求不高等特點(diǎn)。已在臨床、食品、植物病理、微生物生態(tài)、獸醫(yī)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［31－32］。

分離于紫花苜蓿種子的多粘類芽孢桿菌HTBRC 1～8具有比多粘類芽孢桿菌ACCC 10252更強(qiáng)的耐鹽性。但使用多粘類芽孢桿菌HTBRC1等浸泡的紫花苜蓿種子，是否將更能適應(yīng)鹽漬地幫助紫花苜蓿度過較高鹽濃度的脅迫，有待進(jìn)一步的研究。在試驗(yàn)過程中用代表菌株多粘類芽孢桿菌HTBRC1浸泡過的種子比未浸泡的種子具有更好的發(fā)芽率，發(fā)芽勢，根長和苗長，這將有助于紫花苜蓿在自然生態(tài)環(huán)境下形成建植優(yōu)勢。本試驗(yàn)證明了多粘類芽孢桿菌可以促進(jìn)紫花苜蓿生長，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與國內(nèi)外報道的多粘類芽孢桿菌具有促進(jìn)植物生長的結(jié)果一致［4，13，17，33］；并在試驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)未經(jīng)多粘類芽孢桿菌菌懸液浸泡過的苜蓿種子在發(fā)芽試驗(yàn)中有真菌侵染苜蓿芽，影響其發(fā)芽的現(xiàn)象，但未鑒定其苜蓿芽侵染真菌的種類，有待后續(xù)研究多粘類芽孢桿菌對病原真菌的拮抗作用及其機(jī)制。

表3 紫花苜蓿種帶菌株HTBRC 1～8和多粘類芽孢桿菌ACCC 10252的表型特征Table 3 Phenotypic characteristics of HTBRC 1－8from M． sativa seeds and P． polymyxa ACCC 10252

本研究首次明確了多粘類芽孢桿菌在甘肅省不同紫花苜蓿種植區(qū)所收獲種子上的分布。分離自紫花苜蓿種子表皮及內(nèi)部的多粘類芽孢桿菌具有較高耐鹽性和促進(jìn)紫花苜蓿生長的新特性。本研究為苜蓿生產(chǎn)提供了菌種資源及其理論基礎(chǔ)。

致謝：承蒙蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院王彥榮教授惠贈紫花苜蓿種子資源和曾彥軍副教授在種子選擇時給予的有益建議，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)陳秀蓉教授和楊成德及蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院段廷玉副教授在技術(shù)方面，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院王瑋和鄒德福在氣象數(shù)據(jù)方面提供的幫助，謹(jǐn)此一并致謝。

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