根際促生菌篩選及其接種劑對箭筈豌豆生長影響的研究

馬文彬，姚拓，王國基，張玉霞，榮良燕

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅 蘭州730070）

土壤微生物是土壤有機(jī)復(fù)合體的重要生物組成部分，在有機(jī)物質(zhì)分解、物質(zhì)循環(huán)和生態(tài)安全調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用，適宜群居在具有一定界限的微域環(huán)境里，如根際微域。植物根際的微生物多而活躍，由于受根系生長及其分泌物的影響，根際微生態(tài)區(qū)域土壤微生物的數(shù)量和種群結(jié)構(gòu)顯著不同于非根際土壤，構(gòu)成了根際特有的微生物區(qū)系。植物根際促生菌（PGPR）是一類定殖于植物根際，可通過固定空氣中的氮氣（即生物固氮）或溶解土壤中不能被植物直接吸收利用的磷素（即生物溶磷）或產(chǎn)生植物生長激素刺激植物生長以增強(qiáng)其吸收礦物營養(yǎng)和水分的能力，從而促進(jìn)植物生長［1－3］的有益菌。自1978年Burr和Schroth在馬鈴薯（Solanumtuberosum）上率先報道PGPR以來，大量的研究事實證實PGPR廣泛存在于多種植物，近年來，國內(nèi)外學(xué)者已從一些植物根際分離篩選出大量高效優(yōu)良的根際促生菌株［4－5］，利用優(yōu)良促生菌株研制的“環(huán)境友好型”接種劑還可改良土質(zhì)，增進(jìn)土壤肥力，維持土壤健康，是發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)的理想肥料。

箭筈豌豆（Viciasativa）是糧、草、飼、肥兼用作物之一，在我國草地農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中起著舉足輕重的作用，與燕麥（Avenasativa）混播，調(diào)制青干草，用于冬春補(bǔ)飼，是解決牧區(qū)家畜營養(yǎng)不足的有效措施［6－8］；其根茬還田可培肥地力、增加后作產(chǎn)量，還能改善土壤理化性狀、提高土壤有機(jī)質(zhì)含量及促進(jìn)農(nóng)田養(yǎng)分循環(huán)［9］，同時是優(yōu)良的水土保持和固沙植物，具有飼用和生態(tài)雙重價值。

根系是植物吸收水分和養(yǎng)分的重要組織器官，其形態(tài)發(fā)育影響作物的生長及對營養(yǎng)的吸收，其中根系長度和根表面積對主要借擴(kuò)散抵達(dá)根表面的那些養(yǎng)分有效性具有決定性作用，因此研究根的形態(tài)學(xué)特征（總根長、根系表面積、根系平均直徑及根系體積等）有著重要意義。近年來，關(guān)于氮、磷等植物必需營養(yǎng)元素及干旱脅迫對根系形態(tài)影響的研究越來越多［10－13］，而生物因素尤其是微生物對根系形態(tài)的影響鮮有報道。為此，本研究以箭筈豌豆為研究對象，從箭筈豌豆及玉米（Zeamays）根際分離篩選優(yōu)良促生菌，并研制微生物接種劑，結(jié)合半固體培養(yǎng)液試驗研究接種劑對箭筈豌豆生長及根系形態(tài)的影響，為箭筈豌豆的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)生產(chǎn)及推廣提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1．1 供試材料

箭筈豌豆根系及根際土壤，2013年9月采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草試驗站；玉米根系及根際土壤，2013年8月采自甘肅省武威黃羊鎮(zhèn)牧草試驗站。箭筈豌豆種子，品種為春箭筈豌豆，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院種子室提供。接種劑對箭筈豌豆生長影響測定于2014年1月下旬至3月上旬進(jìn)行。

1．2 培養(yǎng)基

LB（溶菌肉湯培養(yǎng)基）［14］：用于活化及保存菌種；NFM（無氮培養(yǎng)基）［14］：用于聯(lián)合固氮菌分離及固氮酶活性測定；PKO（Pikovaskaia’s）［14］：用于溶磷菌分離及溶磷量測定；YMA（甘露醇硝酸鹽瓊脂培養(yǎng)基）［14］：用于根瘤菌分離及培養(yǎng)；CCM（聯(lián)合碳源培養(yǎng)基）［14］：用于分泌生長素測定；Hoagland（霍格蘭）半固體培養(yǎng)基［15］：提供箭筈豌豆幼苗營養(yǎng)。

1．3 優(yōu)良促生菌株分離篩選

1．3．1 菌株分離 按常規(guī)分離細(xì)菌法分別涂布樣品懸液于PKO及NFM固體培養(yǎng)基平板上，28℃倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑取在PKO平板上出現(xiàn)透明圈的分離物進(jìn)行純化并保存；在NFM平板上挑取長勢較好的分離物進(jìn)行純化保存。

將所采集新鮮的箭筈豌豆根瘤用無菌水洗凈，0．1%升汞消毒3min，挑取中間部位，在YMA培養(yǎng)基平板上點接或劃線，分離得到的菌株進(jìn)一步純化保存于冰箱中備用。

1．3．2 菌株溶磷性能測試 將菌株點接種至PKO固體培養(yǎng)基上，28℃條件下培養(yǎng)7d，觀察菌落周圍有無溶磷圈出現(xiàn)，并測定菌落直徑與溶磷圈直徑，定性判斷菌株溶磷能力；制備上述菌株懸浮液（濃度約108cfu／mL），接種0．5mL菌懸液于盛有經(jīng)滅菌的50mL PKO液體培養(yǎng)基的三角瓶中，每菌株3次重復(fù)，置于軌道搖床上（28℃，160r／min）培養(yǎng)10d，在4℃下離心（10000r／min）15min，取上清液用鉬藍(lán)比色法測定有效磷（P）的含量。

1．3．3 菌株固氮酶活性測定 利用NFM培養(yǎng)基，將供試菌株分別接種于盛有5mL半固體NFM培養(yǎng)基的血清瓶中（每菌株5次重復(fù)），結(jié)合氣相色譜儀（Trace GC2000，Italy），利用乙炔還原法（acetylene reduction assay，ARA）測定菌株固氮酶活性［16］，按下式計算固氮酶活性。

式中，hx：樣品峰值；hs：標(biāo)準(zhǔn)C2H4峰值；C：標(biāo)準(zhǔn)C2H4濃度（nmol／mL）；V：培養(yǎng)容器體積（mL）；t：樣品培養(yǎng)時間（h）；N：產(chǎn)生的C2H4濃度（nmol／mL·h）。

1．3．4 菌株分泌IAA能力研究 取上述在CCM液體培養(yǎng)基上生長12d的菌株懸浮液40mL，盛于50mL離心管中（每菌株3次重復(fù)），在4℃，10000r／min下離心10min，棄去沉淀物，將上清液在冷凍干燥儀中干燥至10～15mL，并用HCl將PH值調(diào)至2．8。用乙酸乙酯提取生長素（IAA）（菌株懸浮液∶乙酸乙酯＝1∶3）。將提取液盛在燒杯中，置于通風(fēng)櫥中低溫蒸發(fā)至干燥，再用2mL 100%乙醇溶解后盛在離心管中。同時配置50 μg／mL的IAA標(biāo)準(zhǔn)液。利用液相色譜法（HPLC）測定菌株IAA含量［17］。

色譜條件，色譜柱：ZORBAX SB－C18柱（4．6mm×150mm，5μm）；流動相：甲醇∶0．6%冰乙酸（45∶55）；柱溫：25℃；流速1mL／min；檢測波長：254nm；進(jìn)樣量：20μL。

1．3．5 菌株拮抗測定 菌株間的拮抗反應(yīng)測試采用牛津杯法［18］，將一種菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h的菌懸液，以2%（V／V）的量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、180r／min振蕩培養(yǎng)48h；發(fā)酵液8000r／min離心10min，上清過0．22μm濾膜，取濾液100μL滴加在含有2%另一種細(xì)菌的LB平板中央的牛津杯中（直徑7mm），待發(fā)酵濾液擴(kuò)散后置28℃條件下恒溫培養(yǎng)。以無菌水作陰性對照。將供試4株細(xì)菌兩兩進(jìn)行抑菌實驗，每個處理3次重復(fù)，1d后觀察抑菌圈的有無，若有抑菌圈，說明兩細(xì)菌間有拮抗作用，若無抑菌圈，且細(xì)菌生長良好，則說明這兩個細(xì)菌可以共存，各菌株間沒有拮抗作用，不發(fā)生拮抗反應(yīng)的菌株可以混合培養(yǎng)，否則只能單獨施用。

1．4 對箭筈豌豆生長影響測定

1．4．1 菌懸液制備 將LB斜面培養(yǎng)基上生長72h的上述菌分別接種于100mL LB液體培養(yǎng)基中，置于28℃，125r／min的搖床培養(yǎng)3～5d，測定A660值，使A660值均大于0．5，無菌水調(diào)節(jié)A660值一致（使菌數(shù)量處于同一水平），制成菌懸液，并按表1設(shè)置處理（注：菌株種類及其組合、體積比等正在申報專利）。

表1 試驗處理Table 1 Design of experiment

1．4．2 種植 選取籽粒飽滿、大小均一的春箭筈豌豆種子，將種子先用75%的酒精滅菌處理15s，然后用無菌水沖洗4～5次，再經(jīng)0．1%HgCl2滅菌處理1min后，用無菌水沖洗干凈，將種子置于滅菌后的水瓊脂培養(yǎng)基平板中，置于培養(yǎng)箱（25℃，16h光照，20000lx；20℃，8h黑暗）中培養(yǎng)，待種子芽長1～2cm，將箭筈豌豆幼苗移至裝有40mL無菌Hoagland水瓊脂半固體培養(yǎng)基的長玻璃試管（4cm×45cm）中，每個試管1株幼苗，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d后觀察，去除移栽后死亡的幼苗。

1．4．3 接種 將1．4．1中各菌懸液1mL在無菌條件下接入1．4．2所培養(yǎng)的幼苗根際，接種后將試管繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)1組對照，每個處理5次重復(fù)。

1．4．4 測定項目與方法 經(jīng)處理的幼苗培養(yǎng)40d后收獲，用無菌水洗凈根表培養(yǎng)基，測量株高及根長；剪去地上部分，利用根系掃描儀（LA2400Scanner，Epson Expression 1000XL）測定根表面積、根體積及根平均直徑；用濾紙吸干植株及根系表面水分，分別稱量其地上部分和地下部分鮮重；根系活力的測定采用TTC（氯化三苯基四氮唑）法進(jìn)行根系還原力的測定。

1．5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007整理數(shù)據(jù)，SPSS 17．0進(jìn)行方差分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2．1 優(yōu)良促生菌株促生特性

通過測定菌株的溶磷、固氮及分泌生長素能力，篩選出了4株優(yōu)良菌株，包括2株溶磷菌，1株聯(lián)合固氮菌，1株根瘤菌（表2）。其中，菌株J3－1和J1－15為溶磷菌，兼具分泌生長素特性，Y16為聯(lián)合固氮菌，兼具溶磷及分泌生長素性能，J3為根瘤菌。4株菌株生長速度均較快，經(jīng)測定均無拮抗作用。

2．2 接種劑對箭筈豌豆株高和生物量影響

2．2．1 接種劑對箭筈豌豆株高影響 通過測定接種劑對箭筈豌豆株高的影響，由表3得知，與G處理（CK，下同）相比，各接種劑對箭筈豌豆的株高影響各異?？傮w來說，復(fù)合接種劑的效果優(yōu)于單一接種劑和CK，除處理C外，單一接種劑處理與CK差異不顯著（P＞0．05），但處理B較CK增加4．5%。復(fù)合接種劑均較CK處理的株高增加22．9%～31．6%。單一接種劑中，C與A、B之間差異顯著（P＜0．05），復(fù)合接種劑中，E、F與處理D差異顯著（P＜0．05）。

表2 優(yōu)良菌株促生特性Table 2 Characteristics of tested plant growth promoting rhizobacteria strains

表3 接種劑對箭筈豌豆株高和生物量影響Table 3 Effect of plant growth promoting rhizobacteria inoculum on height and biomass in vetch

2．2．2 接種劑對箭筈豌豆生物量影響 接種劑對箭筈豌豆地上生物量的影響與對株高的影響趨勢基本一致，但C處理對地上生物量的影響優(yōu)于復(fù)合接種劑，較CK增加了104．5%，且與復(fù)合接種劑差異顯著（P＜0．05），A和B處理與CK相比，均有不同程度的下降，但與CK差異不顯著；復(fù)合接種劑各處理較CK增加了42．6%～83．7%。各處理對地下生物量的影響比對株高和地上生物量的影響顯著（P＜0．05），較CK增幅為51．5%～254．1%。綜上所述，單一接種劑C及各復(fù)合接種劑處理對箭筈豌豆地上和地下部分均有良好的促進(jìn)作用。

2．3 接種劑對箭筈豌豆根系形態(tài)影響

接種劑對箭筈豌豆根系形態(tài)的影響顯著，觀察根系外觀形態(tài)（圖1），接種促生菌劑后各處理均根系發(fā)達(dá)，側(cè)根較多且細(xì)，主根較長；CK側(cè)根短粗，數(shù)量較少，主根較短。接種劑對箭筈豌豆根系形態(tài)指標(biāo)的影響表明（表4）：與CK相比，接種劑對根長、根表面積及根體積的影響均顯著，各處理間差異也顯著，且根表面積與根體積的變化趨勢基本一致。其中，較CK相比，各處理對根長的增幅為30%～70%，處理F和C對根長的促進(jìn)效果最為明顯；各處理對根表面積影響的排序為：C＞F＞D＞E＞A＞B＞G，對根體積的影響為F＞C＞D＞E＞B＞A＞G，除處理C外，總體上表現(xiàn)出復(fù)合接種劑效果優(yōu)于單一接種劑。接種劑處理對根平均直徑的影響則相反，各處理較CK相比均有不同程度下降，且差異顯著。

2．4 接種劑對不同根直徑下箭筈豌豆根長和分布影響

由表5可見，接種劑處理對0～0．5mm內(nèi)細(xì)根［19］根長影響顯著。C處理0～1．0mm內(nèi)的根長顯著高于其他處理，而0．5～1．0mm級別下根長差異不大。分析根長在各級別的分布比例可知，接種劑各處理50%以上的根在0～0．5mm直徑范圍內(nèi)，且接種植株該范圍內(nèi)根系長度所占比例明顯高于未接種植株（圖2），95%左右的箭筈豌豆根是在0～1．0mm的直徑范圍內(nèi)，說明細(xì)根的多少決定根長的大小。

圖1 接種劑對箭筈豌豆根系外觀形態(tài)影響Fig．1 Effects of plant growth promoting rhizobacteria inoculum on root morphology in vetch

表4 接種劑對箭筈豌豆根系形態(tài)指標(biāo)影響Table 4 Effect of plant growth promoting rhizobacteria inoculum on root traits of vetch

表5 接種劑處理對不同根直徑下的總根長影響Table 5 Effect of inoculum on vetch in root length under different root diameter cm／株P(guān)lant

圖2 接種劑對箭筈豌豆根系直徑分級影響Fig．2 Effect of inoculum on vetch in different root diameter

2．5 接種劑對箭筈豌豆根系活力影響

如表6所示，不同接種劑處理下，箭筈豌豆根系活力變化明顯。復(fù)合接種劑除E處理，其效果優(yōu)于單一接種劑處理和CK，單一接種劑A處理與CK差異不顯著。使用復(fù)合接種劑處理，箭筈豌豆根系活力較CK提高3．5%～38．3%，其中F處理效果最佳，與其他處理差異顯著，D處理次之；單一接種劑C較CK增加8．0%，處理B雖與CK差異不顯著，但與CK相比增加4．97%。這表明，復(fù)合接種劑處理提高根系活力效果明顯，但因處理不同差異較大。

3 討論

植物根際促生菌因具有多種有益生物學(xué)作用，成為國內(nèi)外研究熱點。Hamdali和Ouhdouch［20］從摩洛哥含無機(jī)磷酸鹽土壤中分離出8株解磷放線菌，它們以植物根分泌物為營養(yǎng)，釋放土壤中有機(jī)磷，可使該地區(qū)小麥（Triticumaestivum）地上部分增長70%，根增長30%。Mirz等［21］將分離自水稻（Oryzasativa）根際的固氮菌株AzospirillumN－4接種于水稻根際，測得水稻根系增重78．1%，莖稈增重59．0%。Oliveira等［22］通過溫室試驗證明，水稻接種聯(lián)合固氮菌Herbaspirillum和Azospirillum后的固氮百分率分別為19%和47%。我國應(yīng)用海洋細(xì)菌BAC－991的 PGPR對大豆（Glycinemax）、蔬菜等平均增產(chǎn)10．00%～18．19%，最高可達(dá)35%［23］。康貽軍等［24］對豇豆（Vignasesquipedalis）的研究表明，接種兩種促生菌后豇豆株高分別比對照提高14．39%和10．40%；莖葉干物重分別比對照增加19．69%和17．71%。劉佳莉等［25］利用從鹽堿土壤中分離出的促生菌株A－2和A－4處理燕麥種子，可有效促進(jìn)燕麥生長并提高燕麥的鹽堿抗性。

表6 接種劑對箭筈豌豆根系活力影響Table 6 Effect of plant growth promoting rhizobacteria inoculum on root activity of vetch

本研究不同處理組合的接種劑對箭筈豌豆株高、生物量及部分根系形態(tài)等生長指標(biāo)均有不同程度的促進(jìn)作用，但處理之間差異較大。姚拓等［26］研究也證實，接種不同供試固氮菌株對燕麥生長的影響各異，大多數(shù)菌株明顯促進(jìn)燕麥生長（株高、根長、根表面積和生物量），與本研究結(jié)果具有一定的相似性。其中處理F為溶磷菌、聯(lián)合固氮菌及根瘤菌復(fù)合處理，促進(jìn)效果表現(xiàn)最為優(yōu)良，尤其是對根系活力的提高作用顯著，這與溶磷菌與根瘤菌之間的互作效應(yīng)是密不可分的。溶磷菌溶解的磷礦粉能作為根瘤菌的磷源，促進(jìn)其生長繁殖，為植株提供更多的氮素。此外，菌株本身的生理特性、菌株互作效應(yīng)及接菌方式等因素都可顯著影響菌對寄主植物的促生效果。張英等［27］對4株根際促生菌的互作效應(yīng)研究表明，部分菌株混合后其有效磷增量及分泌IAA量均呈現(xiàn)“1＋1＞2”的加成效應(yīng)。韓華雯等［28］利用單一促生菌株和菌株組合對紫花苜蓿（Medicagosativa）產(chǎn)量的研究表明，菌株組合效果優(yōu)于單一菌株。本研究中部分菌株組合后效果也呈現(xiàn)出此趨勢，如對株高的影響為組合處理E、F均高于單一接種劑。本研究僅證明接種劑在水溶液難溶性磷條件下能夠溶解部分無效態(tài)磷、并結(jié)合固氮作用提供氮素供植株吸收利用，對自然土壤狀況下接種劑的應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。

接種劑對根系生長可以起到良好的促進(jìn)作用，主要表現(xiàn)在根長、生物量、根表面積及根體積等形態(tài)學(xué)變化上，但根系直徑較CK相比均有不同程度減小，CK根系直徑最大，但其根表面積最小，這也從另一方面說明了根系直徑越小其接觸面積越大，越有利于對養(yǎng)分和水分的吸收利用，這與王寧和秦艷［29］對三葉鬼針草（Bidenspilosa）接種AM真菌的研究結(jié)果一致。一般認(rèn)為，根系活力能反映根系吸收能力的強(qiáng)弱，其強(qiáng)弱直接影響植株對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而影響地上部的生長發(fā)育。馮莉等［30］研究證實，利用熒光假單胞菌處理煙草根系，其根系活力顯著提高。本研究除A處理外，其他處理均可提高箭筈豌豆根系活力，以處理F效果最佳。根系活力提高說明根系發(fā)達(dá)，側(cè)根數(shù)及根質(zhì)量增加，這與上述根系形態(tài)的變化相一致。

根系形態(tài)特征與植物利用土壤養(yǎng)分的效率密切相關(guān)［31］，多數(shù)研究證實，低磷脅迫下植物根系會發(fā)生適應(yīng)性變化，如無磷脅迫下大豆根長、根表面積與根體積比低磷及高磷條件下顯著提高，但根系直徑減?。?1］。本研究通過接種溶磷菌，營養(yǎng)液中低磷脅迫下有效磷含量增加，加之箭筈豌豆種子較大，本身含磷量較高，在接種促生菌劑后箭筈豌豆根長、根表面積與根體積明顯提高，而根系直徑減小，說明微生物對根系形態(tài)的影響與低磷脅迫響應(yīng)機(jī)制不同，可能是促生菌劑能增加根系分枝強(qiáng)度［29］。由于多數(shù)促生菌都可分泌生長素，而生長素誘導(dǎo)可刺激側(cè)根的產(chǎn)生［32］，因此，也可能與某些植物激素的調(diào)控有關(guān)。

以往研究關(guān)于箭筈豌豆根際微生物的報道較少，并且主要集中在根瘤菌與箭筈豌豆共生效應(yīng)方面，有關(guān)溶磷菌、固氮菌及根瘤菌復(fù)合接種劑的研究尚未見報道。本研究對箭筈豌豆根際促生菌篩選及接種劑對其生長的影響進(jìn)行了較為系統(tǒng)的前期試驗，對保障農(nóng)牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本試驗中菌株的分子生物學(xué)鑒定是下一步研究的重點。

4 結(jié)論

篩選出4株根際優(yōu)良促生菌，其中J3－1、J1－15具有較高溶磷量，Y16兼具溶磷、固氮及分泌生長素性能，J3為根瘤菌，4株菌在后期應(yīng)用中具有較高潛力。

利用篩選的優(yōu)良促生菌株制備的接種劑對箭筈豌豆地上及根系生長有促進(jìn)作用，接種劑C及F對箭筈豌豆具有較好的促進(jìn)作用，有望成為后期研制菌肥的最佳菌株及組合。

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