牙鲆連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系的遺傳特征分析

侯吉倫，李 超，王桂興，張曉彥，孫朝徽，王玉芬，姜秀鳳，劉海金

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站，河北秦皇島066100；2.上海海洋大學(xué)，上海201306；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京 100141）

1 前言

在一般情況下，硬骨魚類排出體外的成熟卵子處于第二次減數(shù)分裂中期。魚類的這種繁殖特征為魚類的細(xì)胞工程育種，例如：多倍體誘導(dǎo)、雄核發(fā)育誘導(dǎo)以及雌核發(fā)育誘導(dǎo)。人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育是一種快速固定母本性狀、生產(chǎn)單性化苗種以及建立純系的有效手段。根據(jù)原理的不同，人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育又可進(jìn)一步被分為減數(shù)分裂雌核發(fā)育（Meiogynogenesis）和有絲分裂雌核發(fā)育（M itogynogenesis）。減數(shù)分裂雌核發(fā)育比有絲分裂雌核發(fā)育更易操作，有更高的誘導(dǎo)率，目前已經(jīng)成功地應(yīng)用于上百種魚類[1～3]。

牙鲆（Paralichthys olivaceus）是一種重要經(jīng)濟(jì)魚類，雌性個(gè)體生長速度明顯比雄性快。中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站運(yùn)用雌核發(fā)育誘導(dǎo)技術(shù)，選育的全雌牙鲆新品種“北鲆1號(hào)”和“北鲆2號(hào)”，具有雌性比例高、生長快、規(guī)格整齊、容易飼養(yǎng)等特點(diǎn)。關(guān)于牙鲆雌核發(fā)育的研究，已經(jīng)有眾多論文報(bào)導(dǎo)[4～6]。王桂興等[7]采用微衛(wèi)星技術(shù)，研究了牙鲆連續(xù)兩代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系的遺傳特征，結(jié)果顯示，第二代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系的純合度、個(gè)體間平均相似度以及親子間的平均相似度要略高于第一代雌核發(fā)育家系，顯著高于對(duì)照家系。

本研究在王桂興等[7]技術(shù)的基礎(chǔ)上，對(duì)性成熟的第二代雌核發(fā)育個(gè)體再度誘導(dǎo)減數(shù)分裂雌核發(fā)育，獲得三個(gè)連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系，并利用 30對(duì)微衛(wèi)星引物分析了該三個(gè)家系的純合度和遺傳相似度，旨在探討牙鲆連續(xù)多代雌核發(fā)育過程對(duì)等位基因純合進(jìn)程的影響，為牙鲆通過連續(xù)多代減數(shù)分裂雌核發(fā)育方法建立純系以及優(yōu)良品種選育提供相應(yīng)的數(shù)據(jù)支持。

2 材料和方法

2.1 連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站開展。2007年，以真鯛精子作為異源精子，經(jīng)紫外線照射滅活，激活一尾雌性野生牙鲆所產(chǎn)卵子，并在激活后3m in，施以3℃，45m in的冷休克處理進(jìn)行減數(shù)分裂雌核發(fā)育誘導(dǎo)，獲得第一代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系（Meio-G1）。2009年，利用Meio-G1內(nèi)發(fā)育成熟的一尾個(gè)體再度誘導(dǎo)減數(shù)分裂雌核發(fā)育，獲得連續(xù)第二代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系（Meio-G2）。2014年，以Meio-G2家系內(nèi)三尾性成熟個(gè)體進(jìn)行減數(shù)分裂雌核發(fā)育誘導(dǎo)，獲得了三個(gè)連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系（Meio-G3-1、Meio-G3-2、Meio-G3-3）。

2.2 樣品采集與基因組DNA提取

采集作為母本的三尾Meio-G2的腹面胸鰭和Meio-G3-1、Meio-G3-2、Meio-G3-3家系仔魚各30尾，置于100%酒精中固定，-20℃保存?；蚪MDNA提取采用傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法進(jìn)行[7]。

2.3 微衛(wèi)星引物

微衛(wèi)星引物全部選自Coimbra等[8]繪制的牙鲆第二代遺傳連鎖圖譜，根據(jù)劉永新等[9]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取重組率高、中、低的引物各10對(duì)，所選引物覆蓋牙鲆24個(gè)連鎖群。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列、退火溫度、M-C距離和Genbank登錄號(hào)見表1。

表1 30對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)引物序列、退火溫度、M-C距離和Genbank登錄號(hào)Table1 Primer sequences，annealing temperatures，M-C distance and accession number in Gen Bank of 30 microsatellite lociin the Paralichthys olivaceus

續(xù)表

2.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增及電泳

PCR反應(yīng)體系采用 15μL，包括：10×Buffer 2.5 μL、Mg2+（25 mmol/L）1 μL、dNTPs（2 mmol/L）1μL、上下游引物（10mmol/L）各0.6μL、DNA模板1 μL（40～50 ng）、Taq DNA 聚合酶 1 U，加適量ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4m in；共25個(gè)循環(huán)包括94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s；最后72℃延伸8m in，PCR擴(kuò)增在PE9700型PCR儀上進(jìn)行。PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色后用HPScanjetG4010掃描儀成像，用Gel-Pro Analyzer4.5凝膠分析軟件對(duì)電泳圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)指標(biāo)

等位基因數(shù)（number of alleles，A）、觀測(cè)雜合度（Ho）、純合度（homozygosity）、遺傳相似系數(shù)（genetic similarity index，GSI）等遺傳參數(shù)均由 popgene（ver.3.2）計(jì)算獲得。重組率和近交系數(shù)由以下公式計(jì)算

重組率r=雜合子數(shù)/個(gè)體總數(shù)

近交系數(shù)

式（1）中，F(xiàn)為第i世代的近交系數(shù)；Gi為第i代雌核發(fā)育家系；r為微衛(wèi)星位點(diǎn)的重組率。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR擴(kuò)增及基因純合度

本研究選用的30對(duì)微衛(wèi)星引物在Meio-G3-1、Meio-G3-2、Meio-G3-3三個(gè)家系中均能擴(kuò)增出穩(wěn)定的PCR產(chǎn)物，所擴(kuò)增到的等位基因數(shù)分別為35、38、37，平均等位基因數(shù)為1.17、1.27、1.23（見表2）。平均觀測(cè)雜合度（Ho）分別為0.146 7、0.255 6、0.205 6，平均純合度分別為0.853 3、0.744 4、0.794 4。t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Meio-G3-1、Meio-G3-2、Meio-G3-3三個(gè)家系間的平均觀測(cè)雜合度和平均純合度差異均不顯著（P＞0.05）。

表2 30個(gè)微衛(wèi)星座位上的等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度及純合度Table 2 Number of alleles，observed heterozy gosity and homo zygosity for the 30 microsatellite loci

3.2 連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系內(nèi)個(gè)體間的遺傳相似度

根據(jù)所檢測(cè)的30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因類型，分別計(jì)算了Meio-G3-1、Meio-G3-2、Meio-G3-3家系內(nèi)個(gè)體間的遺傳相似度（見表3）。結(jié)果表明，連續(xù)三代雌核發(fā)育家系內(nèi)個(gè)體間平均遺傳相似度在0.983 8～0.991 8，顯示此群體已經(jīng)是一個(gè)遺傳一致性很高的品系。另外，各家系母本與子代之間的平均遺傳相似度要高于子代之間的相似度。

表3 連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系內(nèi)的遺傳相似度Table3 Genetic similarity within family of the third successive meiogyno genetic generation

3.3 連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系間的遺傳相似度

根據(jù)30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)，計(jì)算了Meio-G3-1、Meio-G3-2、Meio-G3-3三個(gè)家系間的遺傳相似度（見表4）。三個(gè)家系間的遺傳相似度在0.971 4～0.981 0，遺傳距離在0.019 1～0.029 0。三個(gè)家系之間均表現(xiàn)出高度的遺傳相似性。

表4 三個(gè)連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離Table 4 Genetic similarity and genetic distance among three third-generation of successive meiogynogenetic families in Japanese flounder Paralichthy solivaceus

3.4 不同微衛(wèi)星位點(diǎn)的純合效率和近交系數(shù)

在三個(gè)家系中，30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分別檢測(cè)出5個(gè)、8個(gè)和7個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)百分比為16.67、26.67、23.33，其余的各個(gè)位點(diǎn)，母本檢測(cè)到的為單態(tài)，只有一個(gè)等位基因，子代在這些位點(diǎn)的純合性和母本相同，完全純合固定。近交系數(shù)是衡量微衛(wèi)星位點(diǎn)純合速率的一個(gè)指標(biāo)，雜合位點(diǎn)在各家系的近交系數(shù)范圍為0～0.7（Meio-G3-1）、0～0.66（Meio-G3-2）、0～0.98（Meio-G3-3）。不同雜合位點(diǎn)在不同家系表現(xiàn)出不同的純合速率。比如，Poli1431TUF位點(diǎn)在Meio-G3-1和Meio-G3-2家系各觀測(cè)到10個(gè)和9個(gè)純合個(gè)體，而在Meio-G3-3家系中，只有兩個(gè)個(gè)體在此位點(diǎn)為純合；Poli1010TUF位點(diǎn)在Meio-G3-1家系中觀測(cè)到8個(gè)純合個(gè)體，而在Meio-G3-2和Meio-G3-3家系中卻沒有觀測(cè)到純合個(gè)體（見表5）。

表5 部分微衛(wèi)星位點(diǎn)上純合個(gè)體數(shù)量、比率、重組率和近交系數(shù)Table5 Number of homo zygote，recombination frequency，coefficient of inbreeding(F)of some detected microsatellite lociin the third successive meiogynogenetic generation offspring Paralichthys olivaceus

4 結(jié)語

本研究首次報(bào)道了牙鲆三個(gè)連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系的建立，并通過30對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)這三個(gè)家系進(jìn)行了遺傳特征的研究。結(jié)果表明，家系內(nèi)個(gè)體間和家系間都具有高度的遺傳相似性。本研究中只選取一尾親魚的卵子，通過人工誘導(dǎo)減數(shù)分裂雌核發(fā)育，獲得減數(shù)分裂雌核發(fā)育一代家系Meio-G1，再隨機(jī)選取Meio-G1內(nèi)一尾發(fā)育成熟雌性個(gè)體進(jìn)行第二輪減數(shù)分裂雌核發(fā)育的誘導(dǎo)，獲得第二代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系Meio-G2。待Meio-G2家系雌魚性成熟時(shí)，再隨機(jī)選取三尾分別進(jìn)行第三輪減數(shù)分裂雌核發(fā)育的誘導(dǎo)，從而建立了三個(gè)連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系。每一代都只選用單一母本分別進(jìn)行減數(shù)分裂雌核發(fā)育的誘導(dǎo)，在最大程度上確保了遺傳背景的一致性和等位基因代際純化的最大化，從而獲得遺傳相似度高的家系。

遺傳一致性高的動(dòng)物品系對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的可靠性以及可重復(fù)性具有重要意義。在生物學(xué)研究中，獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果包含了處理效應(yīng)、所用生物的遺傳變異、非遺傳變異以及各因素之間的互作。一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是要控制和減少這些變異，從而讓處理的信息更加清晰和可靠。獲得具有高統(tǒng)計(jì)效力實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最佳方法是利用不同近交系具有遺傳異質(zhì)性的少量個(gè)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[10]。在動(dòng)物中，建立近交系最常用的方法為全同胞交配法，運(yùn)用此方法，建立一個(gè)近交系需要至少20代[11]。迄今為止，運(yùn)用全同胞交配法，已經(jīng)建立了數(shù)百個(gè)嚙齒類的近交系[12]。在斑馬魚上，一個(gè)連續(xù)16代的全同胞交配品系也已經(jīng)被建立[13]。相比于傳統(tǒng)的全同胞交配法，人工誘導(dǎo)減數(shù)分裂雌核發(fā)育法具有快速固定母本性狀、提高等位基因純合速率等優(yōu)點(diǎn)。一般認(rèn)為，一代雌核發(fā)育相當(dāng)于8～10代的連續(xù)全同胞交配[14]。在牙鲆上，一代減數(shù)分裂雌核發(fā)育相當(dāng)于9～10個(gè)世代的全同胞交配，連續(xù)第二代減數(shù)分裂相當(dāng)于11～12代全同胞交配[7]。本研究中，三個(gè)家系內(nèi)子代間的平均遺傳相似度在0.981 3～0.991 8，家系間的平均遺傳相似度0.971 4～0.981 0。團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系內(nèi)個(gè)體間的平均遺傳相似度為0.984 5[15]，本研究結(jié)果與之相近。通過誘導(dǎo)連續(xù)三代雌核發(fā)育所獲得的個(gè)體，無論家系內(nèi)，還是家系間，都具有高度的遺傳相似性，接近或略高于連續(xù)20代全同胞交配所獲得的理論結(jié)果（0.986）。因此，連續(xù)誘導(dǎo)多代減數(shù)分裂雌核發(fā)育能建立近交系，且比傳統(tǒng)的全同胞交配法更節(jié)省時(shí)間。

由于減數(shù)分裂過程中，存在著等位基因的重組，而且由于不同等位基因在染色體上的位置不同造成重組率的差異，導(dǎo)致了純合速率的差異，所以導(dǎo)致連續(xù)多代減數(shù)分裂雌核發(fā)育雖能一定程度加速等位基因純化的進(jìn)程，但很難獲得所有位點(diǎn)全部純合的個(gè)體。將連續(xù)多代減數(shù)分裂雌核發(fā)育個(gè)體再進(jìn)行一次有絲分裂雌核發(fā)育的誘導(dǎo)，將能獲得雙單倍體純合子。在牙鲆上，純合度高的個(gè)體比純合度低的個(gè)體具有更高的有絲分裂雌核發(fā)育誘導(dǎo)成功率。

綜上所述，通過連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育誘導(dǎo)所獲得的牙鲆，具有高度的純合性和遺傳相似度，是進(jìn)行牙鲆良種選育（quantitative trait locus）、QTL定位及其他遺傳學(xué)研究的優(yōu)質(zhì)材料。

[1] Arai K.Genetic improvement of aquaculture finfish species by chromosome manipulation techniques in Japan[J].Aquaculture，2001，197：205-228.

[2] Peruzzi S，Chatain B.Pressure and cold shock induction of meiotic gynogenesis and triploidy in the European sea bass，Dicentrarchus labraxL.：Relative efficiency of methods and parental variability[J].Aquaculture，2000，189：23-37.

[3] You C，Yu X，Tan D，et al.Gynogenesis and sex determination in large-scale loachParamisgurnus dabryanus(Sauvage)[J].Aquaculture International，2008，16：203-214.

[4] Yamamoto E.Studies on sex-manipulation and production of cloned populations in Hirame flounder，Paralichthys olivaceus(Temminck et Schlegel)[J].Bulletin of Tottori Prefecture Fishery Experiment Station，1995，34：1-145.

[5] 劉海金，侯吉倫，常玉梅，等.真鯛精子誘導(dǎo)牙鲆減數(shù)分裂雌核發(fā)育[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2010，34(4)：508-514.

[6] Tabata K，Gorie S，Nakamura K.Studies on the gynogenesis in hirameParalichthys olivaceus.II induction of gynogenetic diploid in hirameParalichthys olivaceus[J].Nippon Suisan Gakkaishi，1986，52(11)：1901-1904.

[7] 王桂興，劉海金，張曉彥，等.牙鲆連續(xù)兩代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系的遺傳特征[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2012，19(3)：381-389.

[8] Coimbra M R，KobayashiK，Koretsugu S，etal.AGenetic linkage map of the Japanese flounder，Paralichthys olivaceus[J].Aquaculture，2003，220(1-4)：203-218.

[9] 劉永新，朱以美，劉英杰，等.牙鲆渤海自然群體的遺傳多樣性分析[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2013，37(11)：1609-1617.

[10] Festing M FW.The Design and statistical analysis of animal experiments[J].ILAR Journal，2002，43(4)：191-193.

[11] Casellas J.Inbred mouse strains and genetic stability：A review[J].Animal，2011，5(1)：1-7.

[12] Grimholt U，Johansen R，Sm ith A.A review of the need and possible uses for genetically standardized Atlantic salmon(Salmo salar)in research[J].Laboratory Animals，2009，43(2)：121-126.

[13] Shinya M，Sakai N.Generation of highly homogeneous strains of zebrafish through full sib-pair mating[J].G3(Bethesda)，2011，1(5)：377-386.

[14] 劉靜霞，周 莉，趙振山，等.錦鯉4個(gè)人工雌核發(fā)育家系的微衛(wèi)星標(biāo)記研究[J].動(dòng)物學(xué)研究，2002，23(2)：97-105.

[15] 唐守杰，李思發(fā)，蔡完其.團(tuán)頭魴連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育群體遺傳變異的微衛(wèi)星分析[J].淡水漁業(yè)，2014，44(2)：3-8.