尾葉桉GLU4肉桂酰-輔酶A還原酶基因克隆及原核表達

陳博雯 ，蓋 穎 ，蔣湘寧

（1.北京林業(yè)大學 生物科學與技術(shù)學院，北京 100083；2. 廣西林科院 廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室，廣西 南寧 530002）

尾葉桉GLU4肉桂酰-輔酶A還原酶基因克隆及原核表達

陳博雯1，2，蓋 穎1，蔣湘寧1

（1.北京林業(yè)大學 生物科學與技術(shù)學院，北京 100083；2. 廣西林科院 廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室，廣西 南寧 530002）

肉桂酰-輔酶A還原酶(Cinnamoyl Co-A Reductase，CCR)是木質(zhì)素合成中的關(guān)鍵酶，根據(jù)植物中CCR保守序列設計引物，以尾葉桉GLU4嫩莖為材料克隆到其CCR基因，命名為EuCCR。該基因gDNA長2 918 bp，cDNA長1 045 bp，CDS區(qū)編碼336個氨基酸。EuCCR核酸序列與GenBank已登錄的桉屬植物CCR基因同源性達到96%以上，與傘房屬、杯果木屬植物CCR的同源性達85%以上，其編碼的氨基酸序列經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)具有完整FR_SDR_e結(jié)構(gòu)域及NADP結(jié)合位點和底物結(jié)合位點，與可可樹等植物中CCR基因編碼序列同源性也在84%以上，確定為CCR基因。對EuCCR蛋白序列理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進行生物信息學分析，利用MEGA軟件對基因序列進行系統(tǒng)進化樹分析。采用pQE30/M15系統(tǒng)對EuCCR進行原核表達，重組質(zhì)粒成功表達分子量約36 kD的目的蛋白。本研究從尾葉桉GLU4中克隆得到EuCCR基因并原核表達，為該基因的酶學分析以及利用該基因轉(zhuǎn)化調(diào)控尾葉桉木質(zhì)素合成奠定基礎。

尾葉桉；肉桂酰-輔酶A還原酶；生物信息學分析；原核表達

桉樹是桃金娘科桉屬植物的總稱，原產(chǎn)地為澳大利亞，桉樹品種多、生長快，其木材工業(yè)特性好，堅韌耐腐，是最常用的制造紙漿的主要原料[1-2]。在我國熱帶、亞熱帶地區(qū)多個省份都種植有桉樹人工林[3-8]。廣西的桉樹研究在我國處于領先地位。20世紀70年代初期就開始引種，經(jīng)過多年的引種試驗及雜交選育，得到了多個優(yōu)良樹種、優(yōu)良種源及優(yōu)良家系[2]，截止2010年，全區(qū)桉樹面積達2 480萬畝，占全區(qū)人工商品林面積的30.5%，居全國第1位，桉樹已經(jīng)成為短周期原料林的主要造林樹種，在造紙木漿生產(chǎn)中有著極重要的地位。

木質(zhì)素是植物細胞壁中的一類苯丙烷類衍生物，去除木質(zhì)素是制漿工藝中的重要步驟，直接關(guān)系到整個制漿生產(chǎn)的污染情況和成本高低。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)化木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵酶，從而降低植物木質(zhì)素含量，從根本上減少制漿中都污染成本，是目前的研究熱點。肉桂酰-輔酶A還原酶(Cinnamoyl Co-A Reductase，CCR)催化木質(zhì)素單體的生物合成中第一個特定步驟，它將相應的化合物的CoA 形式轉(zhuǎn)化為醛的形式。是幾種木質(zhì)素單體合成途徑中的共有酶，對木質(zhì)素的合成起重要作用[9]，是調(diào)控木質(zhì)素合成的首選基因。

尾葉桉GLU4無性系(Eucalyptus urophyllaclone GLU4)是廣西審定的桉樹良種，材性適宜造紙，在廣西種植范圍廣，以此樹種作為轉(zhuǎn)基因育種材料，具有良好的應用前景。本研究以尾葉桉GLU4無性系為材料，克隆得到EuCCR基因，并對其序列進行生物學分析， 而后對EuCCR基因進行原核表達分析，為該基因的酶學分析以及更進一步利用該基因轉(zhuǎn)化調(diào)控尾葉桉木質(zhì)素合成奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試材料為尾葉桉GLU4無性系Eucalyptus urophyllaclone GLU4，取自廣西林科院生物工程與技術(shù)研究所苗圃。

DNA secure新型植物基因組DNA提取試劑盒、RNA prep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒及DNA純化、凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。RNA LA PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、LA Taq DNA 聚合酶、克隆載體pMD-18T購自TaKaRa公司，限制性內(nèi)切酶購自 Promega公司，IPTG、X-Gal、Ampicillin、kanamycin購自北京索萊寶科技有限公司。E.coliDH5α、M15菌株及表達載體PQE30為本實驗室保存?；驍U增引物由北京華大基因生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 EuCCR序列PCR擴增

取移栽培養(yǎng)3～4周的GLU4組培苗莖部組織，分別按照試劑盒說明書方法提取基因組DNA和總RNA，并取總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒方法合成cDNA，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在NCBI檢索其他植物中已報道的CCR基因序列，blast分析保守區(qū)用Vector NTI軟件設計引物：

Sense primer CCR-F1: CAATCCCACCATGCC CGTCG

Anti-sense primer CCR-R1: GTGCGCGCCATG ATGGATCTAAGATC

分別以gDNA和cDNA作為模板，擴增目的基因的gDNA片段及cDNA片段。PCR反應擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min（cDNA擴增延伸時間1 min），28個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min，4 ℃保存30 min。

1.3 克隆載體構(gòu)建

gDNA及cDNA PCR擴增產(chǎn)物分別經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下目的條帶凝膠回收后與pMD-18T載體16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，隨機挑取3個陽性克隆用CCR-F1/CCR-R1引物PCR驗證后，由華大基因生物技術(shù)有限公司完成測序。

1.4 序列生物信息學分析

通過NCBI搜索引擎中的Blastn在線工具進行同源性分析；利用NCBI的ORF Finder尋找閱讀框，完成DNA序列的翻譯,并用Blastp分析蛋白序列同源性及保守區(qū)域、活性位點；利用Vector NTI中的AliginX軟件將gDNA和cDNA序列測序結(jié)果比對分析外顯子和內(nèi)含子；運用Expasy網(wǎng)站的ProtParam完成蛋白序列的氨基酸組成、等電點及親疏水性分析；應用丹麥科技大學(DTU)提供的TMHMM和SignalP工具分析序列中的跨膜區(qū)和信號肽；利用ExPaSy中的psipred分析序列二級結(jié)構(gòu)；應用SWISS-MODEL軟件對基因氨基酸序列進行同源三級結(jié)構(gòu)建模并分析；應用MEGA 5.0工具的ClustalW分析EuCCR與其他物種中CCR基因序列，并采用Neighbor-Jioning算法構(gòu)建進化樹

1.5 表達載體構(gòu)建

根據(jù)克隆到pMD-18T載體上的CCR cDNA序列，采用Vector NTI軟件設計引物（帶有酶切位點）

Sense primer CCR-F2(BamHⅠ): GGGGGA TCCATGCCCGTCGACGCCCTC

Anti-sense primer CCR-R2(HindⅢ):GGGAAGCTTTCATCCCTGAATACGCAC

PCR擴增CCR cDNA的CDS序列，擴增產(chǎn)物回收后BamHⅠ/HindⅢ雙酶切，同時將PQE30質(zhì)粒BamHⅠ/HindⅢ雙酶切。 37℃酶切4 h后0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收目的基因片段及線性PQE30質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。挑選陽性克隆用CCR-F2/CCR-R2引物PCR驗證，并用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切驗證。

1.6 原核表達及SDS-PAGE檢測

將驗證后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliM15，Ampicillin、kanamycin雙抗性篩選陽性克隆，接種于 10mL 含Ampicillin、kanamycin的 LB 液體培養(yǎng)基，37℃200 r/min過夜培養(yǎng)，按1%接種量轉(zhuǎn)接至100 mL LB培養(yǎng)基中(含Ampicillin，kanamycin)，振蕩培養(yǎng) 3～5 h 至 OD600為0.4～0.6，加入IPTG 至終濃度為 1 mmol/L，同時設立不加入IPTG的處理作為對照。繼續(xù)振蕩培養(yǎng) 4 h，離心收集菌體，用 1 mL PBS 緩沖溶液懸浮后，超聲波破胞， 離心取8 μL上清液加入2 μL 5×上樣緩沖溶液， 混勻后沸水浴 5 min，離心取5 μL上清SDS-PAGE檢測。 蛋白條帶用考馬斯亮蘭R250染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 GLU4中CCR基因克隆

通過PCR成功的擴增獲得長度分別為3 000 bp、1 000 bp左右的目的片段（見圖1a），與推測的CCR基因的gDNA片段以及cDNA片段長度相符，條帶清晰無非特異性雜帶。目的片段連接至pMD-18T載體后挑選陽性克隆用CCR-F1/CCR-R1引物進行PCR 驗證，分別得到長度為3 000 bp和1 000 bp左右的片段（見圖1b），說明目的片段已經(jīng)成功克隆到pMD-18T載體上，重組質(zhì)粒分別命名為pT-CCR-gDNA和pT-CCR-cDNA，各取3個克隆測序。測序結(jié)果顯示克隆得到的CCR gDNA序列長度2 918 bp，cDNA序列長度1 045 bp。利用NCBI在線blast分析，序列與岡尼桉(X79566.1)，藍桉(AB591264.1)，柳葉桉(AF297877.1)，圓果桉(FJ834288.1)中CCR基因一致性分別為98%、99%、98%、96%，與GenBank已登錄的傘房屬、杯果木屬植物的CCR基因一致性也達到90%(DQ309047.2)，89%(EF612728.1)，85%(DQ309061.1)，且序列中包含有完整CDS，初步說明克隆所得片段為的CCR基因，命名為EuCCR。

圖1 EuCCR基因的克隆Fig.1 Cloning of EuCCR gene

利用NCBI的ORF Finder將EuCCR基因編碼區(qū)翻譯氨基酸序列，編碼336個氨基酸，應用NCBI的blastp比對分析氨基酸序列，結(jié)果顯示序列中包含完整的FR_SDR_e保守結(jié)構(gòu)域以及NADP結(jié)合位點和底物結(jié)合位點(見圖2b)，F(xiàn)R_SDR_e屬于是NADP依賴還原酶家族蛋白特有的保守結(jié)構(gòu)域，在植物黃酮類等次級代謝途徑中的異構(gòu)酶、還原酶和裂解酶中都含有此結(jié)構(gòu)域，與CCR酶學功能相符。氨基酸序列比對表明，EuCCR編碼序列與藍桉(AAT74879.1)、柳葉桉(AAG16242.1)、岡尼桉(CAA56103.1)CCR基因編碼序列一致性為99%，與異心葉桉(AAT74875.1)、圓果桉(ACZ59063.1)、可可樹(EOY26038.1)、橡膠樹(ADU64758.1)、碧桃(EMJ16703.1)、毛白楊(ACE95172.1)、毛果楊(CAC07424.1)中CCR基因編碼序列一致性分別為98%、96%、85%、85%、84%、84%，進一步證實克隆到的基因序列確實為CCR基因。

圖2 EuCCR序列分析Fig.2 Analysis of EuCCR sequence

使用Vector NTI中的AliginX軟件將EuCCR的gDNA和cDNA序列比對，顯示基因含有5個外顯子，4個內(nèi)含子(見圖2a)，其中第4個外顯子和第4個內(nèi)含子為基因中最長的外顯子和內(nèi)含子，這與Poke文獻報道一致[10]。

2.2 EuCCR序列分析

2.2.1 理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)預測

利用ExPaSy中的Protparam工具分析EuCCR編碼蛋白序列，結(jié)果表明該蛋白由336個氨基酸殘基組成，分子式為C1624H2592N434O489S13；相對分子量為36.44 kD；理論pI值為5.87，為酸性蛋白；總平均親水性為-0.078，不穩(wěn)定系數(shù)為30.95，小于40，推斷蛋白質(zhì)為穩(wěn)定性蛋白；從氨基酸組成分析，帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)共41個，帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+ Lys)共36個；綜合分析表明該蛋白質(zhì)是一個帶負電荷的酸性蛋白質(zhì)。

應用丹麥科技大學(DTU)提供的TMHMM在線分析跨膜區(qū)，未發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)，SignalP在線分析結(jié)果顯示，EuCCR編碼蛋白不包含信號肽序列，說明該蛋白不屬于膜蛋白或分泌蛋白，應該是定位于細胞質(zhì)基質(zhì)中，這與該基因的功能定位相符。

利用ExPaSy中的psipred分析序列二級結(jié)構(gòu)，顯示該蛋白具有11個α-螺旋和11個β-折疊結(jié)構(gòu)（見圖3a），運用SWISS-MODEL對EuCCR進行同源三級結(jié)構(gòu)建模。構(gòu)建范圍從第10個氨基酸到第326個氨基酸（見圖3b），其建模參考模板為葡萄的二氫黃酮醇-4-還原酶蛋白，該蛋白也屬于NADP依賴還原酶家族[11]。目標蛋白與參考蛋白的序列比對同源性為76.28%；模型評估E值為0.00e-1，說明此次同源建模可靠性極高，推測EuCCR具有NADP依賴的還原酶功能，這與CCR的酶學功能符合。

2.2.2 系統(tǒng)進化樹分析

在NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索已登錄的CCR蛋白質(zhì)序列，共檢索到920條植物CCR蛋白序列，選擇各科屬植物中的26條序列與EuCCR進行序列比對分析。應用MEGA 5.0工具的ClustalW分析EuCCR與其他物種CCR編碼蛋白序列同源性，并采用Neighbor-Jioning算法構(gòu)建進化樹（見圖4）。

系統(tǒng)進化分析顯示，EuCCR與藍桉、圓果桉、柳葉桉等桉屬植物中CCR聚為一類，之后與杯果木屬、傘房屬植物CCR聚為一類，進化分析結(jié)果與分類學相一致。EuCCR與楊屬、松屬CCR親緣性較遠，但同源性也達到83%和78%，說明CCR在各物種的進化中仍是較為保守的基因，這可能與CCR基因在植物生長中的組成型功能有關(guān)。

2.3 EuCCR原核表達

采 用 引 物 CCR-F2/CCR-R2， 以pT-CCR-cDNA作為模板，PCR擴增EuCCR的完整CDS序列，雙酶切連接pQE30構(gòu)建重組表達載體，采用CCR-F2/CCR-R2引物進行PCR驗證，電泳結(jié)果如圖5a，3個陽性克隆均擴增得到1 045 bp長度的片段。將PCR驗證的3個陽性克隆提取質(zhì)粒進行酶切驗證，電泳結(jié)果如圖5b， 3個陽性克隆均酶切得到了3 600 bp左右的載體片段和1 045 bp的插入外源片段，說明EuCCR原核表達重組載體構(gòu)建成功，命名為pQE30-EuCCR。

圖3 EuCCR蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Protein structure analysis of EuCCR

圖4 EuCCR系統(tǒng)樹進化分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of EuCCR

圖5 pQE30-EuCCR構(gòu)建Fig.5 Vector construction of pQE30-EuCCR

將pQE30-EuCCR轉(zhuǎn)入表達宿主M15中IPTG誘導原核表達，SDS-PAGE結(jié)果如圖6。根據(jù)EuCCR氨基酸序列預測蛋白質(zhì)分子量為36.44 kD，誘導表達后，陽性轉(zhuǎn)化株中出現(xiàn)大小約36 kD 的蛋白條帶，與預期相吻合，未加IPTG的對照則沒有相應的條帶，說明重組質(zhì)粒經(jīng) 1.0 mmol/L IPTG 誘導 3 h 后成功表達目的蛋白。

圖6 EuCCR基因原核表達SDS-PAGE結(jié)果Fig.6 Prokaryotic expression SDS-PAGE of EuCCR

3 結(jié)論與討論

CCR是木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵酶，被認為是潛在的碳向木質(zhì)素分配的控制關(guān)節(jié)點，是調(diào)控植物木質(zhì)素合成的理想靶標[12]。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)負調(diào)節(jié)煙草中CCR，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中木質(zhì)素含量明顯降低同時一些非正常的酚類物質(zhì)增加[13-14]。部分反義轉(zhuǎn)化CCR的轉(zhuǎn)基因植株中，S 與G 木質(zhì)素含量均降低的同時，伴隨生長停滯，葉型卷縮，花期延長，導管變形，木質(zhì)部有顏色變化等異常表型，但將CCR 和CAD 負調(diào)節(jié)的單轉(zhuǎn)基因植物雜交，可以得到木質(zhì)素含量降低且表型正常的后代，說明兩個基因可能協(xié)同作用降低木質(zhì)素含量[15]，也說明木質(zhì)素含量明顯降低的植物至少在自然條件下可以進行正常的發(fā)育。

Poke等[10]對23個桉樹樹種的CCR基因遺傳進化關(guān)系進行研究，測序得到大約44%的CCR基因，序列只限于內(nèi)含子 4和部分外顯子 4和5，并未得到CCR的完整CDS。根據(jù)Poke等提交的序列分析，其部分外顯子序列與本研究中得到EuCCR具有很高的一致性，更進一步確定了EuCCR的可靠性。

本研究利用RT-PCR技術(shù)從尾葉桉GLU4幼苗莖部組織中克隆到肉桂酰輔酶A還原酶基因，利用多種生物信息學工具通過同源比對、保守序列及功能位點分析、同源建模、系統(tǒng)進化樹構(gòu)建等方法對EuCCR進行序列分析，確定其為尾葉桉GLU4無性系中的CCR基因，為下一步構(gòu)建反義或RNAI載體轉(zhuǎn)化植株奠定基礎。在本研究中，通過亞克隆構(gòu)建原核表達載體對EuCCR進行原核表達，得到分子量與預期一致的CCR蛋白，也為下一步EuCCR的酶學活性分析提供了材料。

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Cloning and prokaryotic expression of cinnamoyl Co-A reductase ofEucalyptus urophyllaclone GLU4

CHEN Bo-wen1,2, GAI Ying1, JIANG Xiang-ning1
(1. School of Biology Science and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2. Guangxi Key Lab. of Superior Timber Trees Resource Cultivation, Guangxi Forestry Research Institute, Nanning 530002, Guangxi, China)

Cinnamoyl Co-A reductase is a key enzyme in lignin synthesis pathway. A CCR gene was cloned from the immature stem ofEucalyptus urophyllaclone GLU4 and namedEuCCRby using specif i c primers based on the highly conserved sequences of plant CCR. The gDNA and cDNA sequence ofEuCCRwere 2918 bp and 1045 bp respectively, which CDS encodes 336 amino acid residues.EuCCRhad more than 96% sequence homology withEucalyptusthat had been logged in GenBank, and its homology withAngophoraandCorymbiawere over 85%.EuCCRencoding sequence was analyzed, the result shows it has an entire FR_SDR_e domain, a NADP binding site and a substrate binding site. The homology with Theobroma cacao and others were over 84%. The physicochemical property, structure of EuCCR and its phylogenetic analysis were analyzed by using bioinformatics tools and MEGA. The SDS-PAGE analysis showed thatEuCCRwas transformed into pQE30/M15 system and fusion protein with molecular weighting about 39 kD was successfully expressed in transformant. The cloning and expression ofEuCCRgene provided some effective resources for enzymology research and further transgenic research.

Eucalyptus urophylla; Cinnamoyl Co-A reductase; bioinformatics analysis; prokaryotic expression

S792.39

A

1673-923X(2014)11-0071-06

2014-01-12

國家自然科學基金項目（31400522）；廣西林業(yè)科技項目（桂林科字[2014]第33號）；廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室開放課題基金項目（12A0302）

陳博雯（1983-），女，博士研究生，主要從事植物生物技術(shù)方面的研究；E-mail：grf i_bwchen@163.com

蔣湘寧（1958-），男，教授，主要從事植物分子生物學方面的研究；E-mail:xiangning_jiang@163.com

[本文編校：吳 毅]