馬尾松二代育種親本遺傳多樣性分析

朱亞艷 ，何 花 ，秦 雪 ，趙 楊 ，謝維斌

（1.貴州大學(xué)，貴州 貴陽 550025； 2. 都勻國家林木良種基地，貴州 都勻558000）

馬尾松二代育種親本遺傳多樣性分析

朱亞艷1，何 花1，秦 雪1，趙 楊1，謝維斌2

（1.貴州大學(xué)，貴州 貴陽 550025； 2. 都勻國家林木良種基地，貴州 都勻558000）

以貴州都勻馬寨馬尾松種子園33個(gè)家系優(yōu)良單株的針葉為材料，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性分析，從100個(gè)引物中篩選出12個(gè)多態(tài)性引物進(jìn)行擴(kuò)增，建立了最適的PCR反應(yīng)體系。結(jié)果表明：共獲得169 條清晰可辨的條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出14.08個(gè)條帶，其中多態(tài)性帶139 條，多態(tài)位點(diǎn)百分率為82.25%；33份材料的平均觀測(cè)等位基因數(shù)為1.822 5，有效等位基因?yàn)?.575 5，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)為0.325 4，Shannon信息指數(shù)為0.475 8；利用UPGMA法將33份材料分為3類，遺傳距離介于0.174 1～0.586 6 之間，親緣關(guān)系樹狀圖從分子水平顯示了33個(gè)家系個(gè)體間的親緣關(guān)系，為馬尾松親本選配提供了理論指導(dǎo)。

馬尾松；二代育種；遺傳多樣性；ISSR

馬尾松Pinus massoniana是我國分布最廣的針葉樹種，也是南方地區(qū)主要的造林用材樹種。馬尾松栽培歷史悠久，生長適應(yīng)性強(qiáng)，全樹綜合利用率高，是我國木材加工、造紙、林產(chǎn)化工和食療保健等工業(yè)的生產(chǎn)原料，同時(shí)也是荒山綠化的先鋒樹種，在林業(yè)生產(chǎn)中占有顯著地位[1]。種子園是林木良種的生產(chǎn)基地，種子園建園親本選配的好壞將直接關(guān)系到種子園的成敗。遺傳多樣性主要指種內(nèi)不同居群之間或同一居群不同個(gè)體之間遺傳變異的總和[2]，種子園的遺傳多樣性則是指不同層次育種材料，如個(gè)體、家系或無性系的遺傳變異，這些遺傳變異是植株適應(yīng)環(huán)境變化的重要因素，是人工選育優(yōu)良遺傳型最基礎(chǔ)的成分。種子園的遺傳多樣性狀況直接影響其形成林分的穩(wěn)定性，是種子園長期遺傳改良的物質(zhì)基礎(chǔ)[3]，而往往種子園的遺傳增益和遺傳基礎(chǔ)是矛盾統(tǒng)一的，種子園的遺傳多樣性是建立在遺傳增益的基礎(chǔ)上的，只有保證種子園有較高的遺傳增益，才能發(fā)揮種子園的作用；同時(shí)又必須保證種子園有較寬的遺傳基礎(chǔ)，才能保證種子園的質(zhì)量[4]。

ISSR（inter-simple sequence repeat）標(biāo)記技術(shù)具有穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于林木親緣關(guān)系的鑒定[5]。此外，聚丙烯酰胺凝膠分辨率高，它能同時(shí)快速地檢測(cè)出隨機(jī)分布在基因組上大量不同的DNA片段，一次選擇性擴(kuò)增就能比較分析幾十甚至上百個(gè)位點(diǎn)，同時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)后的產(chǎn)物經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)到的譜帶通常在50～100條之間，是檢測(cè)DNA多態(tài)性的一個(gè)非常有用的技術(shù)[6]。

目前，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)，研究親本間的親緣關(guān)系與遺傳差異，用以指導(dǎo)雜交親本的選配和雜種優(yōu)勢(shì)的預(yù)測(cè)，成為林木遺傳育種領(lǐng)域的熱點(diǎn)[7]。根據(jù)張一等[8]的研究發(fā)現(xiàn)：親本的ISSR遺傳距離與子代樹高、胸徑等生長性狀及其雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)為顯著的線性正相關(guān)，隨著親本遺傳距離增大，子代各生長性狀的雜種優(yōu)勢(shì)將呈線性增加。因此，選擇生長性狀優(yōu)良、遺傳距離較遠(yuǎn)的個(gè)體作為育種親本，有望獲得性狀優(yōu)良的子代。

1 材料與方法

1.1 材料來源

材料來自貴州都勻馬鞍山林場(chǎng)的馬尾松1.5代無性系種子園子代測(cè)定林，根據(jù)生長性狀從48個(gè)家系中選出33個(gè)平均長勢(shì)較好的家系優(yōu)良單株采集針葉，放于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 DNA的提取

采用改良的CTAB法從馬尾松針葉內(nèi)提取基因組DNA，提取的DNA經(jīng)純化后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度。

1.2.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立

從100條引物中篩選出12條多態(tài)性好的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立PCR擴(kuò)增體系。ISSR引物由上海生工公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的銀染

利用聚丙烯酰胺凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，250 V恒定電壓下電泳至第二條帶距離板底面5～10 cm時(shí)停止電泳。

1.2.4 數(shù)據(jù)的處理及方法

ISSR為顯性標(biāo)記，同一引物擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶具有同源性。根據(jù)電泳結(jié)果進(jìn)行擴(kuò)增帶的人工統(tǒng)計(jì)，對(duì)于特定引物擴(kuò)增出的每一條帶看作一個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)位點(diǎn)，所有模板都具有的為單態(tài)性位點(diǎn)，僅部分模板具有的為多態(tài)性位點(diǎn)[9]。同一位置條帶有記為1，無記為0，利用Popgene32軟件分別計(jì)算有效等位基因數(shù)（Ne）和Shannon多樣性指數(shù)（I）等，利用NTSYS-pc 2.1對(duì)33個(gè)樣本進(jìn)行聚類分析，繪制親緣關(guān)系聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立

利用3個(gè)家系的馬尾松針葉對(duì)100對(duì)引物進(jìn)行初篩，初步篩選出24條引物進(jìn)行下一步的篩選，再利用8個(gè)家系的馬尾松針葉對(duì)篩選出的24條引物進(jìn)行復(fù)篩，最終選出12條多態(tài)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的引物分別對(duì)33份材料進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系如下。ISSR-PCR 反應(yīng)總體積為20 μL，組分為：DNA模板2 μL（約200 g），引物 4 μL（10 μmol），2×Mix（10 μL），ddH2O 4 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，然后94℃30 s，52℃退火40 s，72℃延伸80 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，最后4℃保存，PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2.2 聚丙烯酰胺凝膠銀染體系的建立

經(jīng)優(yōu)化后的聚丙烯酰胺凝膠銀染（結(jié)果如圖1所示）反應(yīng)條件如下。

圖1 銀染結(jié)果Fig.1 Result of silver staining

（1）取膠：電泳完畢后，小心地將凝膠取下后置入用于銀染的塑料盤中；（2）固定：加入新配置的固定液（10%的冰乙酸），輕微震蕩至染料顏色消失；（3）洗膠：加入去離子水漂洗2次，每次2 min；（4）染色：將凝膠放入染色盤中，倒入新配置的染色液（0.5 g AgNO3、0.75 mL 37% 的甲醛、500 mL去離子水），避光，輕微震蕩30 min，用去離子水漂洗凝膠10 s后，置入顯影液中；（5）顯影：加入顯影液（15 g NaOH、1.5 mL 37%的甲醛、1 L去離子水），分2次顯影，輕微震蕩直至marker條帶清晰為止；（6）定影：加入10%的冰乙酸，輕搖3～5 min，用蒸餾水漂洗數(shù)分鐘；（7）晾干：用玻璃透析紙將膠平整的固定，室溫放置，自然風(fēng)干。

2.3 ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

經(jīng)過初篩和復(fù)篩，從100個(gè)ISSR引物中，選出12個(gè)多態(tài)性好、重復(fù)性強(qiáng)的引物對(duì)子代測(cè)定林33個(gè)馬尾松家系的基因組總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出169個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶139條，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為82.25%，條帶大小在100～2 000 bp之間。不同引物擴(kuò)增的條帶數(shù)9～22條不等，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出14.08條帶，其中多態(tài)性最高的為100%，引物808擴(kuò)增出的條帶最多，達(dá)22條，引物812擴(kuò)增出的條帶為20條，雖然引物859只擴(kuò)增出9條帶，但條帶間距過小，在相同的上樣量和電泳條件下，相對(duì)其它引物擴(kuò)增的條帶顏色更亮，說明該引物擴(kuò)增出的條帶大小相對(duì)集中（擴(kuò)增結(jié)果如表1所示）。由于ISSR揭示的是基因組DNA在酶切位點(diǎn)和其后的選擇性堿基的變異，不同引物同一材料可獲得不同的ISSR圖譜；同一引物不同家系間擴(kuò)增出的條帶也不相同，充分表現(xiàn)了供試材料間DNA水平上的遺傳差異[10]。

2.4 遺傳多樣性參數(shù)分析

利用Popgene32軟件對(duì)子代測(cè)定林家系進(jìn)行分析，得到33個(gè)馬尾松家系優(yōu)良單株的平均觀察等位基因數(shù)（Na）為1.822 5，平均有效等位基因數(shù)（Ne）為1.575 5，Nei’s 基因多樣性指數(shù)（H）為0.325 4，Shannon信息指數(shù)（I）為0.475 8。這表明馬尾松家系間遺傳變異較小。

表1 不同引物的擴(kuò)增結(jié)果Table 1 Amplification results of different primers

2.5 家系間親緣關(guān)系分析

根據(jù)ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，分析33個(gè)馬尾松家系的遺傳相似度和遺傳距離（見表2），結(jié)果表明：33個(gè)家系間的遺傳距離變化范圍在0.174 1～0.586 6之間，變化范圍不大。其中，家系1（黃1）和家系2（黃2）的遺傳距離最近，為0.174 1；家系13（黃31）和家系22（岑16）的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.586 6，其次為家系7（黃16）和家系25（余1），家系20（岑12）分別和家系30（三穗2）、家系32（奉黃2）、家系33（奉黃3）遺傳距離均為0.555 2。33個(gè)馬尾松家系遺傳相似度為0.574 0～0.840 2，這與馬尾松子代測(cè)定林建園時(shí)人工選擇有關(guān)。

表2 遺傳相似度和遺傳距離?Table 2 Genetic identity and genetic distance

利用ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果，參照張黨權(quán)等的方法[11]，應(yīng)用NTSYS-pc 2.1對(duì)33個(gè)樣本進(jìn)行聚類分析，并繪制親緣關(guān)系聚類圖（見圖2）。結(jié)果表明：家系1（黃1）和家系2（黃2）相似度最大，相似系數(shù)為0.840 2，說明家系1與家系2的親緣關(guān)系最近。以相似系數(shù)0.68為閥值，可將馬尾松子代測(cè)定林家系分為3類，其中：黃39、岑12親緣關(guān)系較近，聚為一組；黃24、黃27、黃16、黃31、黃29、岑2親緣關(guān)系較近，聚為一組；剩下的25個(gè)家系為一組。

圖2 33個(gè)家系的聚類結(jié)果Fig.2 Clustering result of 33 Pinus massoniana family

3 討論與結(jié)論

種子園是林木良種繁育的主要形式，種子園的營建是種子園技術(shù)的核心內(nèi)容。自1983年以來，馬尾松種子園營建技術(shù)被列為國家科技攻關(guān)課題，而后經(jīng)過“七五”、“八五”、“九五”國家科技攻關(guān)[12]，在馬尾松種子園的營建管理、紙漿材的定向培育、高世代育種、雜交育種、營養(yǎng)繁殖等方面的研究取得了重大突破，在南方建立了大規(guī)模的良種繁育基地，選育出一批優(yōu)良的種源和家系、無性系。目前，馬尾松的遺傳改良已進(jìn)入第二代，然而，在種子園從一代逐步過渡到二代的過程中，建園親本所受的選擇強(qiáng)度逐步加大，親本間的遺傳關(guān)系在種子園配置中也難以避免[13]，因此，在種子園親本選配時(shí)，對(duì)親本遺傳多樣性進(jìn)行分析，避免因近交而導(dǎo)致種子園子代適合度下降、種子品質(zhì)低劣等，所以對(duì)建園親本進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系的分析，在種子園建設(shè)中顯得更為重要。

由于分子標(biāo)記能夠從DNA水平上反映個(gè)體間的差異，從分子水平上揭示林木的遺傳多樣性，近年來，DNA分子標(biāo)記已被廣泛地應(yīng)用于林木遺傳多樣性與品種指紋圖譜的構(gòu)建、基因定位及分子輔助選擇育種、雜種優(yōu)勢(shì)的預(yù)測(cè)等諸多方面。分子標(biāo)記技術(shù)在林木遺傳育種中的應(yīng)用，使林木的選育工作直接在DNA水平上進(jìn)行，極大地提高了早期測(cè)定的精確度與可靠性，縮短了育種周期，加速了林木育種的進(jìn)程，對(duì)林木開展遺傳多樣性的研究和林木遺傳改良提供了科學(xué)依據(jù)。

本試驗(yàn)利用ISSR分子標(biāo)記分析了馬尾松子代測(cè)定林33個(gè)家系馬尾松的遺傳多樣性，每條引物可以擴(kuò)增出9～22條帶，多態(tài)性水平為82.25%；李廣軍等[14]利用相同的方法對(duì)廣西古蓬種源的馬尾松遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明：在供試的3個(gè)馬尾松天然林內(nèi)，馬尾松多態(tài)性位點(diǎn)百分率為94.35%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于子代測(cè)定林多態(tài)性百分率，這說明馬尾松天然林遺傳多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于種子園子代測(cè)定林的遺傳多樣性，這與種子園受人工選擇的強(qiáng)度有關(guān)；張薇等[15]利用SSR分析標(biāo)記對(duì)馬尾松實(shí)生種子園22個(gè)家系進(jìn)行遺傳多樣性分析，共檢測(cè)到71個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)引物擴(kuò)增出4～7條多態(tài)性條帶，明顯低于ISSR擴(kuò)增出的條帶，與SSR相比，ISSR更適合馬尾松遺傳多樣性的分析。

馬尾松是南方地區(qū)主要的造林用材樹種，在貴州省每年的造林面積中，馬尾松林占面積的1/4～3/4，且先后在貴陽、黃平等地建立了種子園4處(約200 hm2)，種子園是林木良種基地的重要組成部分，是提高林木種子遺傳品質(zhì)、提高造林良種利用率、獲得良種的有效途徑。但是，由于低世代的種子園建園親本選擇只能進(jìn)行早期的選擇，很多性狀都未充分表現(xiàn)出來，選擇的盲目性較大，且生產(chǎn)的種子遺傳品質(zhì)相對(duì)較低，未能充分發(fā)揮馬尾松的遺傳潛力；此外，隨著建園馬尾松家系人工選擇的強(qiáng)度增加，人工控制授粉強(qiáng)度加大，導(dǎo)致馬尾松育種親本間遺傳多樣性降低，最終造成可供造林的馬尾松良種數(shù)量不足、良種缺口大，嚴(yán)重制約我省速豐林和木材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，深入了解馬尾松種子園遺傳多樣性與家系間的親緣關(guān)系，可為馬尾松種子園控制授粉、親本選配和優(yōu)良種質(zhì)資源的利用提供理論指導(dǎo)，避免因近交而造成種子繁殖能力衰退、遺傳基礎(chǔ)單一化等問題。本試驗(yàn)中，二代馬尾松種子園建園親本候選材料多態(tài)位點(diǎn)百分率為82.25%，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)為0.325 4，Shannon信息指數(shù)為0.475 8，家系間遺傳相似度為0.574 0～0.840 2，候選材料遺傳多樣性偏低，且相似度較大，這與馬尾松種子園建園材料來源有關(guān)，該種子園內(nèi)馬尾松多來源于貴州省內(nèi)，因此，在建立二代種子園時(shí)，應(yīng)增加建園親本的數(shù)量，并適當(dāng)從其他種源或地理位置相對(duì)較遠(yuǎn)的地區(qū)選出一批生長性狀好的家系作為建園親本，以增加該種子園的遺傳多樣性。

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Analysis on genetic diversity for second-generation breeding parents ofPinus massoniana

ZHU Ya-yan1, HE Hua1, QIN Xue1, ZHAO Yang1, XIE Wei-bin2
(1. Guizhou University, Guiyang 550025, Guizhou, China; 2. State Forest Farm in Duyun, Duyun 558000, Guizhou, China)

The needles of 33Pinus massonianafamily superior individual from the seed orchard in Mazai of Duyun, Guizhou province were analyzed in genetic diversity by using ISSR molecular marker technology, 12 polymorphic primers were screened out from 100 primers for amplif i cation and establishing the optimal PCR reaction system, and thus the optimal PCR reaction system was established.Totally 169 clear bands were induced, on average 14.08 bands were amplif i ed from per primer, and including 139 polymorphic bands,the percentage of polymorphic bands was 82.25%; Observed from the 33 experimental materials, the mean observed number of alleles was 1.822 5, the effective number of alleles was 1.575 5, the Nei’s gene diversity index (H) was 0.325 4 and the Shannon information diversity index (I) was 0.475 8. UPGMA cluster analysis indicated the 33 individuals were divided into 3 groups, and the genetic distances were between 0.174 1 to 0.586 6. The dendrogram of phylogenetic relationship tree showed the among 33 individuals genetic there were genetic relationship judging from the molecular level, which provides the theoretical basis and guidance for the selection and matching of seed orchard parents.

Pinus massoniana; second-generation breeding; genetic diversity; ISSR molecular marker technology

S722.3

A

1673-923X(2014)09-0065-05

2013-12-10

貴州省重大科技專項(xiàng)（黔科合重大專項(xiàng)字[2012]6011號(hào)）；貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合NY字[2010]3062號(hào)）

朱亞艷（1988-），女，云南昆明人，碩士研究生，研究方向林木遺傳育種；E-mail：zyynjfu@163.com

趙 楊（1974-），男，河南信陽人，教授，博士，主要從事林木遺傳育種教學(xué)與科研；E-mail：zhy737@126.com

[本文編校：謝榮秀]