水杉種子GC/MS聯(lián)用指紋圖譜的建立

楊俊杰，王海燕，馬俊義

(信陽農(nóng)林學(xué)院 a.信陽市中藥資源開發(fā)工程技術(shù)研究中心；b.信陽市中藥分析檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 信陽464000)

水杉種子GC/MS聯(lián)用指紋圖譜的建立

楊俊杰a,b，王海燕a,b，馬俊義a,b

(信陽農(nóng)林學(xué)院 a.信陽市中藥資源開發(fā)工程技術(shù)研究中心；b.信陽市中藥分析檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 信陽464000)

采用水蒸氣蒸餾法從10批水杉種子中提取揮發(fā)油，采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)分析揮發(fā)油的主要化學(xué)成分及其相對含量，建立水杉種子的GC/MS指紋圖譜。結(jié)果表明：水杉種子揮發(fā)油主要含有8個(gè)共有特征峰，各峰的相對保留時(shí)間基本一致（RSD＜0.5%），其相關(guān)系數(shù)（≥94%）、相似度（≥90%）、夾角余弦（≥95%）、相似性比（≥0.89）均達(dá)良好水平。本指紋圖譜具有較好的特征性，能夠反映產(chǎn)地差異情況，可用于水杉種子的質(zhì)量鑒別。

水杉種子；揮發(fā)油；指紋圖譜；氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)

天然藥物與人類的生存和生活密切相關(guān)，是人們預(yù)防和治療疾病的重要武器。其中，木本植物是我國傳統(tǒng)中草藥的重要組成成分，常用的有厚樸[1]、杜仲[2]、肉桂[3]、五味子[4]等。目前，林源活性物質(zhì)及天然功能成分已經(jīng)成為天然藥物開發(fā)的一個(gè)重要資源，受到廣泛的重視。例如銀杏功能活性成分提取分離技術(shù)[5]、油桐的藥用價(jià)值研究[6]、黃連木的藥用價(jià)值研究[7]等都取得不錯(cuò)的成果，活性成分如松科植物精油[8]、樟樹根材的化學(xué)成分[9]等都取得了重要進(jìn)展。水杉Metasequoia glyptostroboides作為一種常見的栽培樹種，據(jù)中醫(yī)藥文獻(xiàn)記載，其具有清熱解毒、消炎止痛之功效，用于癰瘡腫痛，蘚瘡等癥[10]。筆者對水杉種子揮發(fā)油成分及抑菌作用進(jìn)行了研究[11]，并對其抑菌機(jī)理[12]和抗氧化活性[13]進(jìn)行了分析，認(rèn)為其在抑菌劑和抗氧化劑開發(fā)方面有著廣闊的應(yīng)用前景。為了進(jìn)一步挖掘水杉種子資源，特對其主要活性成分揮發(fā)油進(jìn)行指紋圖譜研究，為水杉種子藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物水杉種子采集于2013年11月前后，1～8號樣品來自河南信陽市浉河區(qū)，9號樣品來自河南雞公山自然保護(hù)區(qū)，10號樣品來自河南省羅山縣。經(jīng)信陽農(nóng)林學(xué)院周巍副教授鑒定為杉科植物水杉屬水杉的成熟種子。乙醚、無水硫酸鈉均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取

采集水杉成熟種子，粉碎，用水蒸氣蒸餾法提取2 h，分離水油混合物，無水硫酸鈉干燥，得到淺黃色有濃郁香氣的揮發(fā)油。將揮發(fā)油用乙醚稀釋10倍，備用。

1.2.2 揮發(fā)油化學(xué)成分測定儀器及條件

采用氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）測定。型號，Agilent6850/5975 GC/MSD；檢索圖譜庫，NIST05譜庫。色譜條件：HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm），載氣為色譜純氦氣，流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量1.0 μL，分流比20∶1，程序升溫，設(shè)定柱初溫為60 ℃，保持2 min后，以10 ℃/min升至230℃，運(yùn)行6 min。質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，掃描范圍29～350 amu，四極桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃，EM電壓1 400 V。

1.2.3 建立氣相氣質(zhì)聯(lián)用指紋圖譜的方法

參照宋興良等[14]、楊濱等[15]的研究結(jié)果，制定本研究方法。由于本檢測儀器與“《藥典》指紋圖譜”軟件和“浙江大學(xué)指紋圖譜”軟件不兼容，故參照沈陽藥科大學(xué)指紋圖譜體系，采用EXCEL計(jì)算相似度。

2 結(jié)果與分析

2.1 水杉種子揮發(fā)油成分分析

用毛細(xì)管氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對水杉種子揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行分析，利用色譜峰面積歸一法測得各組分的相對含量，經(jīng)NIST05質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，并與標(biāo)準(zhǔn)圖譜核對，確定其成分。

2.2 記錄時(shí)間的確定

取供試品溶液，精密吸取1.0 μL進(jìn)樣，記錄色譜時(shí)間2 h。發(fā)現(xiàn)20 min后無吸收峰出現(xiàn)，故記錄時(shí)間確定為20 min。

2.3 水杉種子揮發(fā)油 GC/MS圖譜的重復(fù)性和重現(xiàn)性考察

重現(xiàn)性試驗(yàn)：取同批水杉種子揮發(fā)油，分別在0、8、24、48 h內(nèi)，精密吸取1.0 μL進(jìn)樣，考察指紋圖譜中規(guī)定色譜峰的絕對保留時(shí)問、相對保留時(shí)間、面積百分比的一致性，試驗(yàn)結(jié)果表明，疊加的色譜圖峰位基本重合，樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定（見圖1）。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同批次水杉種子揮發(fā)油，精密吸取1.0 μL進(jìn)樣，進(jìn)行色譜條件測定，平行操作5次。試驗(yàn)結(jié)果表明，5次測定結(jié)果穩(wěn)定，各共有峰的相對保留時(shí)間、峰面積比值及色譜相似度基本一致，表明方法重復(fù)性良好（見圖2）。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 指紋圖譜的制備

將10批次水杉種子揮發(fā)油，精密吸取各供試品溶液1.0 μL，分別進(jìn)行色譜條件測定，記錄20 min內(nèi)的氣相色譜質(zhì)譜圖。10批次水杉種子揮發(fā)油離子圖具有較高的一致性（見圖3）。

2.4.2 共有峰的確定

對10批次測定的GC/MS總離子流圖進(jìn)行對比，篩選出8個(gè)強(qiáng)度較大的共有峰，其中以α-蒎烯的色譜峰積分百分比最大且最穩(wěn)定，因此選擇為參照物峰，其標(biāo)號為S，其余共有峰的標(biāo)號依次為 1（s）、2、3、4、5、6、7、8（見圖4）。

圖2 水杉種子揮發(fā)油的重復(fù)性Fig. 2 Repeatability of volatiles in seeds of M. glyptostroboides

圖3 10批水杉種子揮發(fā)油離子圖比較Fig. 3 Comparison of volatiles ion in seeds of 10 batches M. glyptostroboides

圖4 水杉種子揮發(fā)油的指紋圖譜Fig. 4 Fingerprint of volatiles in seeds of M. glyptostroboides

2.4.3 保留時(shí)間和相對峰面積的計(jì)算

以α-蒎烯為參照物，計(jì)算各共有色譜峰的相對保留時(shí)間（見表1）和峰面積百分含量（見表2）。由表1得知各峰的相對保留時(shí)間基本一致（RSD＜0.5%），由表2得知，8個(gè)特征峰平均面積總百分含量為(87.710±4.861)%。

2.4.4 指紋圖譜的確定

以8個(gè)共有峰建立指紋圖譜（見圖4）。根據(jù)表2確定各組分的相對百分含量。其中1號峰 為 α-蒎 烯（36.294±4.861）%，2號 峰 為 莰烯（2.995±0.161）%，3號峰為(1S)-6,6-二甲基-2-亞甲基-二環(huán)[3.1.1]庚烷（3.302±0.627）%，4號峰為β-蒎烯（3.377±0.597）%，5號峰為檸 檬 烯（16.680±0.356）%，6號 峰 為 (1S-內(nèi)型)-1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-醇乙酸酯(6.459±3.202）%，7號峰為石竹烯（10.510±1.352），8號峰為石竹烯氧化物（8.096±2.235）%。

表1 各共有峰的相保留時(shí)間Table 1 Relative retention time of each common peak

表2 各共有峰的峰面積百分含量Table 2 Peak area percentage of each common peak

2.4.5 指紋圖譜相似度評價(jià)

采用EXCEL表格計(jì)算10批次樣品的各個(gè)離子峰相似度（見表3），其中以信陽產(chǎn)8批次為標(biāo)準(zhǔn)樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10批樣品相關(guān)系數(shù)≥94%，相似度≥90%，夾角余弦≥95%，相似性比≥0.89%，與分析的結(jié)果一致。其中1～8號樣品呈高度相似性（≥98%），和9號、10號樣品有一定差異性。

表3 10批水杉種子揮發(fā)油相似度比較Table 3 Comparison of similarity in seeds of 10 batches M. glyptostroboides

3 結(jié) 論

水杉種子作為一種新的活性成分資源，到目前為止，相關(guān)研究不多，尚未見到關(guān)于其質(zhì)量控制方面的報(bào)道。揮發(fā)油作為水杉種子的主要活性成份之一，不同產(chǎn)地的產(chǎn)品，其含量和成分都存在一定的差異。通過建立氣質(zhì)聯(lián)用指紋圖譜，可以全面地反映出所含成分的相對關(guān)系，較好地反映出不同產(chǎn)地產(chǎn)品的差異性和相關(guān)性，判斷產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣。

本研究所分析的10個(gè)樣品，含有8個(gè)主要特征成分，8個(gè)共有峰百分含量為(87.710±4.861)%，能夠體現(xiàn)出本品的主要特征，各峰的相對保留時(shí)間和百分含量可作為本品的鑒別特征。其中 (1S-內(nèi)型)-1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-醇乙酸酯、石竹烯含量差異很大，可能跟水杉生長環(huán)境有關(guān)。

本研究所建立的GC/MS色譜條件可使水杉種子揮發(fā)油中各組分達(dá)到較好的分離效果，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性良好，制定水杉種子揮發(fā)油指紋圖譜具有較好的特征性，相關(guān)系數(shù)、相似度、夾角余弦、相似度均比較高，能夠體現(xiàn)出地區(qū)差異性，可作為水杉種子專屬性的指紋圖譜。

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Establishment of GC/MS fi ngerprint of volatile oil of seeds ofMetasequoia

YANG Jun-jiea,b, WANG Hai-yana,b, MA Jun-yia,b
(a. Xinyang Engineering Research Center for Exploitation of Chinese Medicine Resources; b. Xinyang Key Laboratory of Detection and Analysis of Chinese Medicine,Xinyang College of Agriculture and Forestry, Xinyang 464000, Henan, China)

The volatile oil was extracted by water stream distillation method from 10 batches ofMetasequoia glyptostroboidesseeds,analyzed by GC/MS, the GC/MS fingerprint was established. The results show that there were 8 common characteristic peaks，the relative retention time of each peak was consistent (RRSD ＜ 0.5%)，the correlation coefficient (≥ 94%), similarity (≥90%), included angle cosine (≥ 95%), similarity ratio (≥0.89) all reached good level. This established GC/MS fi ngerprint had better characteristics, ref l ected the differences of origin, and can be used for the identif i cation of the seeds ofM. glyptostroboides.

seeds ofMetasequoia glyptostroboides; volatiles oil; fi ngerprints; GC-MS

S759.95

A

1673-923X(2014)09-0112-05

2013-11-10

河南省重大科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（102102110119）；信陽農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校青年教師科研基金（2009ZRKX013）

楊俊杰（1979-），男，河南南陽人，講師，碩士，從事天然藥物活性成份開發(fā)研究

馬俊義（1960-），男，河南固始人，教授，碩士，從事化學(xué)生物活性成分研究與開發(fā)

[本文編校：謝榮秀]