黑荊樹愈傷組織誘導(dǎo)、增殖與分化

唐佳佳，尚旭嵐，洑香香

（南京林業(yè)大學(xué) 森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京210037）

黑荊樹愈傷組織誘導(dǎo)、增殖與分化

唐佳佳，尚旭嵐，洑香香

（南京林業(yè)大學(xué) 森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京210037）

以黑荊樹葉片為外植體，MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，研究了外源激素對愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及分化的影響。結(jié)果表明：外源激素6-BA與IBA組合、6-BA與2,4-D組合、TDZ與IBA組合均可誘導(dǎo)愈傷組織，但誘導(dǎo)率差異達(dá)極顯著水平；不同外源激素組合上誘導(dǎo)的愈傷組織，其增長率為165.21%～208.53%，其中以6-BA與IBA組合的增長率最大；在添加TDZ與IBA的培養(yǎng)基上易分化出不定芽，但不同培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織對不定芽的分化率和芽的生長影響達(dá)極顯著差異。綜合考慮，篩選適宜愈傷組織誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA，誘導(dǎo)率為43.36% ，平均增量和增長率分別為1.04 g和208.53%；最適宜繼代時間為18～21 d；最適宜愈傷組織分化培養(yǎng)基為MS+0.05 mg/L TDZ +0.2 mg/L IBA，分化率為51.85%，每塊愈傷組織上分化5～8個芽點。

黑荊樹；外源激素；愈傷組織；誘導(dǎo)；不定芽分化

黑荊樹Acacia mearnsii為金合歡屬樹種，原產(chǎn)澳大利亞、新西蘭、非洲、印度、斯里蘭卡、美洲中部和印度尼西亞。其生長速度快，功能多，適生范圍廣，是世界上凝縮類單寧含量最高的樹種之一，其樹皮是世界著名的栲膠原料。在低緯度地區(qū)，它是很有發(fā)展前途的造林樹種之一，在提供工業(yè)原料、改善生態(tài)環(huán)境和提高營林經(jīng)濟(jì)效益方面都有著重要的作用[1-3]。黑荊樹常規(guī)繁殖方法以種子繁殖為主，但其種子具有種皮堅硬、外層裹有蠟質(zhì)、不易吸水膨脹等特點，造成發(fā)芽率低且不整齊等問題[4-5]。另外，黑荊樹種子有一定的分化性，其樹形、生長量、抗性、纖維含量等性狀表現(xiàn)差異大，在一定程度上約束了它們的開發(fā)利用[6]。無性繁殖尤其是組織培養(yǎng)能保持母本的遺傳特性，且具有繁殖快，不受場地、季節(jié)和環(huán)境條件限制等諸多優(yōu)點[7]，所以利用組織培養(yǎng)技術(shù)，建立組培快繁體系顯得尤為重要。目前國內(nèi)外工作者初步建立了黑荊樹組培快繁體系[1,8-14]和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系[2,15-16]，主要以芽和莖尖進(jìn)行體外繁殖，有關(guān)愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的研究尚無報道。

本研究以黑荊樹葉片為外植體，從植物生長調(diào)節(jié)劑的種類、質(zhì)量濃度及配比等方面，對愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖和分化培養(yǎng)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，旨在建立高效、完整實用的黑荊樹組培快繁體系，為提取次生代謝產(chǎn)物提供無菌、連續(xù)和一致的培養(yǎng)材料。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備

種子于2012年采自云南楚雄黑荊樹種子園。100 ℃開水處理20 min后換清水浸泡24 h，挑選吸脹的種子播在具珍珠巖和草炭（1∶1）的基質(zhì)中，待苗高達(dá)到約15 cm時即可取外植體。

1.2 方 法

1.2.1 外植體的預(yù)處理及表面消毒

連續(xù)放晴3 d以上的天氣采集頂芽下第2～3個復(fù)葉。流水輕輕沖洗表面臟污后，用洗潔精溶液浸泡振蕩3 min，流水沖洗1 h；瀝干水后，置于超凈工作臺上，用體積分?jǐn)?shù)為70%酒精消毒20 s，無菌水清洗2～3次，然后用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.1% HgCl2消毒8 min，再用無菌水清洗4～5次，每次振蕩2～3 min。將消毒好的葉片切成0.5 cm×1.0 cm的小塊，供接種用。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加外源激素6-BA（1.0、1.5、2.0 mg/L） 和 IBA（0.5、1.0、2.0 mg/L）（組合A）、6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L）和2,4-D（1.0、1.5、2.0 mg/L）（組合B）、TDZ（0.01、0.05、0.10 mg/L）和IBA（0.2、0.5、1.0 mg/L）（組合C）共3個組合，通過3組合2因素3水平共27個處理誘導(dǎo)愈傷組織。每個處理接種12個外植體，3次重復(fù)。定期觀察生長狀況，30 d后統(tǒng)計愈傷組織的誘導(dǎo)情況。

1.2.3 愈傷組織增殖培養(yǎng)

將組合A上培養(yǎng)得到的生長良好的愈傷組織切成大小相近的小塊轉(zhuǎn)接到最適宜誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA上、將組合B上的轉(zhuǎn)接到MS+0.5 mg/L 6-BA +1.5 mg/L 2,4-D上、將組合C上的轉(zhuǎn)接到MS+0.05 mg/L TDZ+0.5 mg/L IBA上增殖培養(yǎng)，每個處理接種5瓶，每瓶3塊，重復(fù)3次。20 d后收獲測鮮質(zhì)量增量和增長率。

1.2.4 愈傷組織生長動態(tài)

選擇生長最佳的愈傷組織增殖培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，接種40瓶，分別于培養(yǎng)后3、6、9、12、15、18、21、24 d各取5瓶稱取愈傷組織質(zhì)量，計算增長倍數(shù)，繪制生長曲線。

1.2.5 愈傷組織分化培養(yǎng)

將1.2.3中繼代培養(yǎng)得到的生長良好的愈傷組織切成大小相近的小塊轉(zhuǎn)接種于6種分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)（見表1），每處理轉(zhuǎn)入12塊，重復(fù)3次。20 d后統(tǒng)計愈傷組織上不定芽的分化情況。

表1 愈傷組織分化培養(yǎng)基Table 1 Callus differentiation media (mg/L)

培養(yǎng)基中瓊脂質(zhì)量濃度為6.0 g/L，蔗糖質(zhì)量濃度為30 g/L，pH值為5.8。除愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)需在外植體接種后暗培養(yǎng)24 h外，其余均在光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度(24±2)℃，光照強(qiáng)度為 50 μmol/(m2·s)，光照時間為 12 h/d。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

利用專業(yè)統(tǒng)計軟件SPPS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并用Duncan氏法進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及分化過程

葉片接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基16 d左右，葉片中間開始凸起，傷口處開始緊貼培養(yǎng)基表面，此時葉片顏色仍為綠色，傷口處為褐色；20 d左右時，在葉片切口處開始出現(xiàn)白色、淡黃色、黃色和綠色的愈傷組織顆粒；30 d后轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d左右，可長成1 cm2左右大小不規(guī)則的愈傷組織。根據(jù)愈傷組織形態(tài)和質(zhì)地可分為以下3種類型：Ⅰ型（見圖1），綠色，有光澤，質(zhì)地致密，表面有小顆粒，需切割分離；Ⅱ型（見圖2），白綠色相間，質(zhì)地致密，表面有小顆粒，需切割分離；Ⅲ型（見圖3），白淡黃色，質(zhì)地松軟，表面較干。愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)25 d左右，Ⅰ型和Ⅱ型愈傷組織基部膨大，表面產(chǎn)生顆粒狀突起，很快分化出綠色芽點；繼續(xù)培養(yǎng)4～5 d后芽點展開，露出約3 mm大小的綠色不定芽，或為叢生狀或為單芽，約一周后小芽開始長大，并萌發(fā)出葉片；Ⅲ型愈傷組織無分化現(xiàn)象，且培養(yǎng)后期愈傷組織嚴(yán)重失水。

圖1 Ⅰ型愈傷組織Fig.1 Callus of Ⅰ-type

圖2 Ⅱ型愈傷組織Fig.2 Callus of Ⅱ-type

圖3 Ⅲ型愈傷組織Fig.3 Callus of Ⅲ-type

2.2 外源激素組合對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度配比的外源激素組合，以黑荊樹葉片為外植體，研究不同激素組合對愈傷組織誘導(dǎo)的協(xié)同作用。試驗結(jié)果（見表2）發(fā)現(xiàn)，外源激素不同組合條件下愈傷組織誘導(dǎo)率都存在極顯著差異（P＜0.01）。

組合A中，愈傷組織誘導(dǎo)率為18.88%～43.4%，愈傷組織主要類型是Ⅰ型。極差分析和多重比較表明此組合下IBA質(zhì)量濃度對愈傷組織誘導(dǎo)率呈極顯著差異，IBA以0.5 mg/L最佳；6-BA對愈傷組織誘導(dǎo)率差異不顯著。此組合下愈傷組織誘導(dǎo)最適宜的培養(yǎng)基為MS+1.0～1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA。

組合B中，低質(zhì)量濃度的6-BA（0.5 mg/L）水平下，愈傷組織誘導(dǎo)率隨2,4-D質(zhì)量濃度的遞增而增加：1.0～1.5 mg/L 2,4-D誘導(dǎo)的愈傷組織呈白綠色相間，質(zhì)地致密，愈傷組織主要類型是Ⅱ型；2.0 mg/L 2,4-D誘導(dǎo)的愈傷組織呈白淡黃色，質(zhì)地疏松，屬Ⅲ型愈傷組織。高質(zhì)量濃度水平的6-BA（2.0 mg/L）下，愈傷組織誘導(dǎo)率隨2,4-D質(zhì)量濃度的遞增而減少，愈傷組織呈綠色，結(jié)構(gòu)致密，量較少。極差分析和多重比較結(jié)果表明此組合下6-BA與2,4-D質(zhì)量濃度對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響均呈極顯著差異，6-BA對愈傷組織的影響力大于2,4-D，6-BA以0.5 mg/L、2,4-D 以1.5～2.0 mg/L最佳?？紤]愈傷組織誘導(dǎo)率和生長狀況，篩選此組合下適宜的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+1.5 mg/L 2,4-D，其愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)60%以上。

組合C中，愈傷組織最高誘導(dǎo)率為52.6%，出現(xiàn)在培養(yǎng)基為MS+0.05 mg/L TDZ+ 0.5 mg/L IBA上，愈傷組織主要類型是Ⅰ型。極差分析和多重比較結(jié)果表明此組合下TDZ與IBA質(zhì)量濃度對愈傷組織誘導(dǎo)率分別呈極顯著和顯著差異。TDZ對愈傷組織的影響力大于IBA，TDZ以0.05 mg/L、IBA以0.2～0.5 mg/L最佳。考慮愈傷組織的誘導(dǎo)率，篩選此組合下適宜的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.05 mg/L TDZ+ 0.5 mg/L IBA。

綜合考慮愈傷組織誘導(dǎo)率、生長狀況、顏色和形態(tài)質(zhì)地等因素，篩選最適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+1.5 mg/L 2,4-D和MS+0.05 mg/L TDZ+ 0.5 mg/L IBA。

表2 不同外源激素組合對葉片愈傷組織誘導(dǎo)率的影響?Table 2 Effects of different treatment of exogenous hormone combinations on callus induction rate

2.3 外源激素組合對愈傷組織增殖的影響

將各激素組合誘導(dǎo)得到的生長良好的愈傷組織分別轉(zhuǎn)接到適宜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（已進(jìn)行篩選）進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)。試驗結(jié)果表明，不同激素及其質(zhì)量濃度組合配比對黑荊樹葉片愈傷組織的增殖有不同程度的影響作用。其中，A組合上(6-BA+IBA)誘導(dǎo)的愈傷組織在繼代培養(yǎng)時平均增量和增長率都達(dá)到最高，分別為1.04 g和208.53%（見表3），且愈傷組織生長表現(xiàn)為快、綠色、有光澤和質(zhì)地致密，和其它處理相比均達(dá)極顯著差異（P＜0.01）。因此，黑荊樹葉片愈傷組織增殖適宜的培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA。

表3 不同處理組合對愈傷組織增殖的影響Table 3 Effects of different treatments on callus proliferation rate

2.4 愈傷組織的生長動態(tài)

將生長狀態(tài)最好的愈傷組織接種到培養(yǎng)基MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)不同時間后的愈傷組織增長倍數(shù)呈“S”型生長曲線（見圖4）。在培養(yǎng)的前9 d，愈傷組織生長較慢；9～18 d，生長速度明顯加快；18～24 d，生長速度又明顯變慢。因此，要獲得較多的愈傷組織，比較經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)時間為18～21 d。

2.5 外源激素組合對愈傷組織分化的影響

圖5 D-f上愈傷組織分化不定芽Fig.5 Adventitious buds differentiated from callus on D-f

圖7 F-f上愈傷組織分化不定芽Fig.7 Adventitious buds differentiated from callus on F-f

圖4 愈傷組織生長曲線Fig.4 Curve of callus growth

將處理D、E和F上得到的愈傷組織分別接種在6種分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽，方差分析表明激素組合對愈傷組織的分化存在極顯著差異（P＜0.01）。在所有組合中，僅e和f能產(chǎn)生不定芽（見圖5～7），其他培養(yǎng)基上無不定芽分化，可見細(xì)胞分裂素TDZ與生長素IBA組合適合于黑荊樹愈傷組織不定芽的分化；6-BA和2,4-D組合不適于愈傷組織芽的分化，但出現(xiàn)根的分化（見圖8）；6-BA和IBA組合的分化培養(yǎng)基上，所有愈傷組織只有增殖，沒有不定芽和不定根發(fā)生（見圖9）。

圖6 E-f上愈傷組織分化不定芽Fig.6 Adventitious buds differentiated from callus on E-f

圖8 E-c上愈傷組織分化不定根Fig.8 Adventitious roots differentiated from callus on E-c

圖9 繼代培養(yǎng)時褐化現(xiàn)象Fig.9 Browning phenomenon in subculture

分化培養(yǎng)基中TDZ的質(zhì)量濃度對愈傷組織分化率、不定芽分化時間和芽的數(shù)量有極顯著影響（見表4）。較高質(zhì)量濃度TDZ（0.05 mg/L）有利于愈傷組織分化不定芽，分化率提高、分化時間提前且不定芽芽點數(shù)量多。

表4 不同處理組合對葉片愈傷組織分化率的影響Table 4 Effects of different treatments on callus differentiation rate

另外，誘導(dǎo)愈傷組織時添加的外源激素組合對后期不定芽的分化也有一定的影響，誘導(dǎo)培養(yǎng)時6-BA和IBA組合上的愈傷組織分化的不定芽效果最好，分化率高，時間短，不定芽數(shù)量多。

3 結(jié)論與討論

在植物愈傷組織培養(yǎng)中，外源激素起著傳遞遺傳物質(zhì)的脫分化、再分化等發(fā)育信號的作用，而外源激素的效果與外植體以及愈傷組織本身內(nèi)源激素的種類和水平有密切關(guān)系[17-18]。本研究表明，黑荊樹葉片在3種組合培養(yǎng)基上都可以誘導(dǎo)愈傷組織，但愈傷組織誘導(dǎo)率、形態(tài)質(zhì)地存在明顯的差異。6-BA與IBA、TDZ與IBA組合較易誘導(dǎo)出綠色、致密的愈傷組織，在適宜的分化培養(yǎng)基上可分化不定芽；6-BA與2,4-D組合中，較高質(zhì)量濃度2,4-D（2.0 mg/L）誘導(dǎo)的愈傷組織顏色近白色且質(zhì)地松軟，分化培養(yǎng)時難分化且再生頻率低，適宜質(zhì)量濃度2,4-D（1.5 mg/L）誘導(dǎo)的愈傷組織顏色白綠色相間，質(zhì)地致密，在適宜的分化培養(yǎng)基上可分化不定芽，這與黑果腺肋花楸葉片愈傷組織誘導(dǎo)與分化的結(jié)果相似[19]。

愈傷組織不定芽分化培養(yǎng)中不同激素質(zhì)量濃度組合作用不同，激素的比例尤為重要[20-23]。本試驗中黑荊樹葉片愈傷組織只有在添加TDZ與IBA的培養(yǎng)基上才可分化不定芽，珍珠相思A.podalyrriifolia[24]、馬占相思A. mangium[25]和厚莢相思A. crassicarpa[26]的愈傷組織也是使用TDZ成功誘導(dǎo)出不定芽，說明TDZ是金合歡屬樹種誘導(dǎo)不定芽的有效植物激素，且低質(zhì)量濃度的TDZ（0.02 mg/L）利于芽點生長。分析認(rèn)為外植體對激素反應(yīng)敏感，再生各個階段都要求較低的激素水平，稍高就表現(xiàn)出抑制生長作用，即表現(xiàn)出激素累積效應(yīng)[27]。添加6-BA與2,4-D的培養(yǎng)基上沒有分化不定芽，原因可能是2,4-D主要是開啟有關(guān)細(xì)胞分裂的基因，使細(xì)胞分裂增殖，但同時抑制了有關(guān)分化基因的表達(dá)[28-29]。

值得一提的是，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中激素的種類和質(zhì)量濃度對愈傷組織分化也有一定的影響[30]，誘導(dǎo)培養(yǎng)時添加6-BA和IBA、分化培養(yǎng)時添加TDZ和IBA更有利于愈傷組織分化不定芽，分析認(rèn)為可能是三者之間相互作用利于愈傷組織誘導(dǎo)與分化；在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加6-BA和2,4-D及分化培養(yǎng)基中添加TDZ和IBA，愈傷組織分化率明顯降低，且培養(yǎng)后期褐化較嚴(yán)重，可能是2,4-D有毒害作用[31]；在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加TDZ和IBA及分化培養(yǎng)基中添加TDZ和IBA，愈傷組織分化率也明顯降低，預(yù)實驗中降低分化培養(yǎng)基中TDZ的質(zhì)量濃度，分化率也沒有提高，分析可能是外植體長時間培養(yǎng)于含高質(zhì)量濃度激素的培養(yǎng)基中易引起愈傷組織生長異常，引起褐變[32-33]。具體原因有待繼續(xù)研究分析。

綜合考慮黑荊樹葉片愈傷組織誘導(dǎo)率、形態(tài)質(zhì)地、增殖倍數(shù)、分化率和不定芽的生長情況等因素，篩選最佳愈傷組織誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA，誘導(dǎo)率為43.4%，平均增量和增長率都達(dá)到最高，分別為1.04 g和208.53%；最佳繼代時間為18～21 d；最佳愈傷組織分化培養(yǎng)基為MS+0.05 mg/L TDZ +0.2 mg/L IBA，分化率為51.85%，每塊愈傷組織上可分化出5～8個芽點。有關(guān)愈傷組織誘導(dǎo)、增殖和分化中出現(xiàn)的褐化現(xiàn)象及不定芽的生長生根有待進(jìn)一步的研究。

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Induction, proliferation, and differentiation ofAcacia mearnsiicallus

TANG Jia-jia, SHANG Xu-lan, FU Xiang-xiang
(College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China)

The leaves ofAcacia mearnsiiwere taken as the explants and MS medium as the basic culture medium to investigate the effects of exogenous hormones on callus induction, proliferation and differentiation. Callus was successfully inducted on MS basal medium supplement exogenous hormones combinations including 6-BA and IBA, 6-BA and 2,4-D, TDZ and IBA, but the induction rates among different combinations reached very signif i cant level. Growth rate of callus varied from 165.21% to 208.53% with callus derived from different mediums, the best growth response was observed in the medium containing 6-BA and IBA. Adventitious buds were easier to differentiate from callus on medium containing TDZ and IBA, however, the effects of calluses inducted from different mediums on differentiation eff i ciency and growth status of buds were very signif i cant. In conclusion, an eff i cient medium for callus induction and proliferation was MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA, its induction rate was 43.36%, its average increment and growth rate were 1.04 g per bottle and 208.53%, respectively; and the optimum duration of proliferation was 18～21 days. For differentiation of adventitious buds from callus, the best differentiation value of 51.85% was conducted on medium MS+0.05 mg/L TDZ +0.2 mg/L IBA, and 5～8 buds occurred on each piece of callus.

Acacia mearnsii; exogenous hormones; callus; induction; differentiation of adventitious buds

S723.1+32.6

A

1673-923X(2014)09-0038-06

2013-12-10

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（編號：201104019）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目（PADA）和江蘇高校協(xié)同創(chuàng)新中心資助項目

唐佳佳（1990- ），女，安徽安慶市人，碩士研究生，主要從事林木種苗科學(xué)與技術(shù)研究；E-mail：tang900622@163.com

洑香香（1969- ），女，江蘇南京市人，教授，博士，主要研究方向：森林培育；E-mail：xxfu@njfu.edu.cn

[本文編校：謝榮秀]