皖南黑豬H—FABP基因5"—上游區(qū)和第二內(nèi)含子的多態(tài)性分析及克隆測(cè)序

2014-01-02 22:57:21張陳華張似青杜波滑志民鄭江平殷

天津農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年1期

張陳華+張似青+杜波+滑志民+鄭江平+殷宗俊

摘要：對(duì)皖南黑豬心臟脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）基因5-上游區(qū)和第二內(nèi)含子的多態(tài)性進(jìn)行分析及克隆測(cè)序，為開展皖南黑豬肉質(zhì)性狀分子育種奠定理論基礎(chǔ)。采用PCR-RFLP（HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ3種限制性內(nèi)切酶）分子標(biāo)記技術(shù)，分析了184頭皖南黑豬H-FABP基因5-上游區(qū)和第二內(nèi)含子區(qū)的遺傳變異情況，并對(duì)該基因的多態(tài)片段進(jìn)行克隆和測(cè)序分析。結(jié)果顯示：（1）在5-上游區(qū)，HinfⅠ位點(diǎn)上存在多態(tài)性，等位基因H的基因頻率為0.62，表現(xiàn)為中度多態(tài)（PIC=0.359 6）；在第二內(nèi)含子區(qū)，HaeⅢ位點(diǎn)上存在多態(tài)性，等位基因D的基因頻率為0.92，表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC=0.130 7）；而MspⅠ位點(diǎn)上尚未檢測(cè)到多態(tài)，基因型均為AA型；HinfⅠ*位點(diǎn)上也存在多態(tài)性，等位基因B的基因頻率為0.78，表現(xiàn)為中度多態(tài)（PIC= 0.282 4）；（2）χ2檢驗(yàn)表明，除5-上游區(qū)HinfⅠ多態(tài)位點(diǎn)外，其他3個(gè)位點(diǎn)均達(dá)到Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05）；（3）對(duì)H-FABP基因3個(gè)多態(tài)片段進(jìn)行克隆測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，HinfⅠ-RFLP是由于1 324 bp處存在T→C的突變引起，HaeⅢ-RFLP是由于1811bp處存在C→G的突變引起，HinfⅠ*-RFLP是由于1 970 bp處存在C→T的突變引起。本試驗(yàn)確證了皖南黑豬H-FABP基因5-上游區(qū)的多態(tài)位點(diǎn)并在第二內(nèi)含子區(qū)檢測(cè)到了HaeⅢ和Hinf*Ⅰ多態(tài)位點(diǎn)，這可為進(jìn)一步分析H-FABP基因不同基因型與IMF含量的關(guān)系，以及確定影響IMF沉積的主效基因提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：皖南黑豬；H-FABP基因；IMF含量；PCR-RFLP；克隆測(cè)序

中圖分類號(hào)：S828 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.01.007

Sequence and Polymorphism Analysis of Wannan Black Pig H-FABP Gene 5-Upstream Region and the Second Intron

ZHANG Chen-hua1， ZHANG Si-qing1， DU Bo1， HUA Zhi-min1， ZHENG Jiang-ping1， YIN Zong-jun2

（1.Shanghai Vocational College of Agriculture and Forestry， Shanghai 201699， China；2. College of Animal Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei，Anhui 230036， China）

Abstract： This paper analyzed， cloned and sequenced the polymorphism of H-FABP gene 5-upstream region and second intron to provide theoretical basis for the breeding of pork quality traits in Wannan Black Pig. The molecular marker techniques of PCR-RFLP （HinfⅠ， HaeⅢ， MspⅠ3 kinds of restriction enzymes）was used， and the genetic variation of H-FABP gene 5'-upstream region and second intron in 184 Wannan Black Pigs was analyzed， moreover， the corresponding polymorphic fragments was cloned and sequenced. The results showed that：（1） there was polymorphism in loci of the Hinf in 5'-upstream region， and the frequency of allele H was 0.62， showing moderate polymorphism （PIC = 0.359 6）； there was polymorphism in polymorphic loci HaeⅢ in the second intron allele the frequency of D was 0.92， showing low polymorphism （PIC = 0.130 7 ）. While there was no polymorphism detected in the loci of MspⅠ， which genotype was AA genotype. polymorphism of Loci of HinfⅠ* was also existed， the frequency of allele B was 0.78， showing moderate polymorphism （PIC = 0.282 4）；（2） Chi-square test showed that 3 polymorphic sites had reached the equilibrium of Hardy-Weinberg （P>0.05）except the polymorphic site of HinfⅠin the H-FABP gene 5'-upstream region. （3） by cloning and sequence analysising three polymorphic fragments in H-FABP gene， we found that HinfⅠ-RFLP was due to T→C mutation in 1 324 bp， HaeⅢ-RFLP was due to C→G mutation in 1 811 bp and HinfⅠ*- RFLP was due to C→T mutation in 1 970 bp. The polymorphic loci of H-FABP gene in 5-upstream region of Wannan Black Pig was validated， and HaeⅢ and Hinf*Ⅰpolymorphic loci were detected in the second intron. The results provided certain data basis to determine the main effect gene that infect intramuscular fat （IMF） deposition for further investigating the relationship between different genotypes in H-FABP gene and variation in IMF content， whether H-FABP locus was the major gene for IMF deposition.

Key words： Wannan Black Pig； H-FABP gene； IMF content； PCR-RFLP； cloning and sequencing

收稿日期：2013-10-21；修訂日期：2013-11-13

基金項(xiàng)目：教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（208059）；安徽省教育廳自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2009A114）；上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院校內(nèi)科研項(xiàng)目（091327）

作者簡(jiǎn)介：張陳華（1985—），男，福建南平人，助教，碩士，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。

通訊作者簡(jiǎn)介：殷宗俊（1967—），男，安徽合肥人，教授，博士，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究。

肌內(nèi)脂肪（Intramuscular fat，簡(jiǎn)稱IMF）含量，與肉質(zhì)成正相關(guān)，影響肉質(zhì)的風(fēng)味、多汁性和嫩度，特別是嫩度。該性狀屬于數(shù)量性狀，遺傳基礎(chǔ)受多基因控制，存在主基因效應(yīng)[1]。常規(guī)育種技術(shù)在提高瘦肉率和生長(zhǎng)速度等方面的同時(shí)，伴隨著脂肪的減少，而且沉積在肌肉內(nèi)的脂肪也同時(shí)減少，從而導(dǎo)致豬肉品質(zhì)下降。一般認(rèn)為2%～3%的IMF含量可產(chǎn)生理想的口感，但目前對(duì)瘦肉率的選擇已經(jīng)使豬肉中平均IMF含量下降至1%～1.5%，低于理想的范圍[2]。據(jù)報(bào)道，IMF含量具有較高的遺傳力（0.6），而與背膘厚間存在中等偏低的不利遺傳相關(guān)（0.3）[3-4]。因此，可以對(duì)IMF含量進(jìn)行遺傳改良，進(jìn)而有效地改善豬肉品質(zhì)。心臟脂肪酸結(jié)合蛋白（Heart fatty acid-binding protein， H-FABP）是FABP家族的一員，是一種低分子量（15 Kda）的胞漿蛋白，由H-FABP基因編碼，參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的運(yùn)輸，主要功能是將脂肪酸從細(xì)胞膜運(yùn)送到β-氧化和三酰甘油及磷脂合成部位[5]。H-FABP在胞內(nèi)與脂肪酸結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)外脂肪酸保持一定的濃度差，促進(jìn)脂肪酸的攝取，進(jìn)而影響脂肪的沉積[6]。Gerbens等[7-10]通過與人類H-FABP cDNA 噬菌斑雜交分離出含豬H-FABP 基因的λ噬菌體，確定豬H-FABP基因的結(jié)構(gòu)特征并將其定位在豬6號(hào)染色體SW316-S0003（16.6 cM）之間，該基因由1.6 kb的上游調(diào)控區(qū)域、0.2 kb的3-端非轉(zhuǎn)錄區(qū)、4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成。其中4個(gè)外顯子分別編碼24，58，34，17個(gè)氨基酸，3個(gè)內(nèi)含子的大小分別為4.2，2.5，1.5 kb，該基因主要在心肌、骨骼肌和乳腺中表達(dá)[11]。Gerbens研究發(fā)現(xiàn)，H-FABP基因在杜洛克豬中存在HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ3個(gè)酶切多態(tài)位點(diǎn)，并認(rèn)為H-FABP基因多態(tài)性可作為IMF含量的侯選基因。隨后又以153頭梅山豬的雜交后代作為供試群體，測(cè)定了H-FABP基因的多態(tài)性、mRNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和背最長(zhǎng)肌上的IMF含量。結(jié)果表明，在HaeⅢ多態(tài)位點(diǎn)基因型之間，IMF含量的遺傳變異與蛋白質(zhì)的表達(dá)水平無關(guān)，而在mRNA水平上存在著顯著的差異，H-FABP基因的mRNA與IMF含量顯著相關(guān)。鑒于前人的研究結(jié)果，本試驗(yàn)選取IMF含量較高的安徽省地方優(yōu)良品種豬即皖南黑豬為試驗(yàn)群體，采用PCR-RFLP方法檢測(cè)皖南黑豬H-FABP基因5-上游區(qū)和第二內(nèi)含子區(qū)不同位點(diǎn)的多態(tài)性及檢測(cè)突變位點(diǎn)的基因型，并對(duì)該基因的多態(tài)片段進(jìn)行克隆和測(cè)序分析。通過對(duì)皖南黑豬H-FABP基因5-上游區(qū)和第二內(nèi)含子區(qū)變異位點(diǎn)的確切位置及引起變異的原因分析，旨在為繼續(xù)研究該基因的不同區(qū)域以確定影響IMF沉積的主效基因，及為皖南黑豬的種質(zhì)資源特性與MAS研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 耳樣試驗(yàn)豬為184頭（均來安徽豐潤(rùn)生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司），用耳號(hào)鉗剪一小塊耳組織（約0.5 g），放入盛有1 mL 70%乙醇的1.5 mL Ep管中，采集的樣品-20 ℃保存。

1.1.2 試劑蛋白酶K、Premix Tag （Version 2.0）購自大連寶生物工程（大連）有限公司，內(nèi)切酶HinfⅠ、HaeⅢ和MspⅠ購自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取參照文獻(xiàn)[12]按常規(guī)方法進(jìn)行基因組DNA的提取，將干燥后的DNA溶于100 μL的TE中，并用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)提取物的質(zhì)量。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增根據(jù)GenBank上注冊(cè)的X98558、Y16180序列，在5-上游區(qū)和第二內(nèi)含子區(qū)用Primer 5.0設(shè)計(jì)2對(duì)引物。引物序列見表1，該引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

PCR擴(kuò)增體系組分（25 μL）：其中Premix Tag （Version 2.0）12.5 μL，模板DNA 2 μL，上下引物（20 μΜ）各1 μL，滅菌蒸餾水8.5 μL。

PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 45 s，退火60 ℃45 s，延伸72 ℃2 min，共33個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切以HinfⅠ酶切PCR1擴(kuò)增產(chǎn)物，以HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ分別酶切PCR2的擴(kuò)增產(chǎn)物。酶切體系20 μL，其中，PCR產(chǎn)物6 μL，10×Buffer 2 μL，限制性內(nèi)切酶1 μL，37 ℃反應(yīng)4 h，酶切產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.4 H-FABP基因 PCR-RFLP片段克隆測(cè)序通過PCR-RFLP分析，將HinfⅠ、HaeⅢ和MspⅠ酶切片段中具有多態(tài)性的不同基因型的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后送交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

1.3.1 基因頻率和基因型頻率的計(jì)算其計(jì)算公式為：

Pi=（2（ii）+（ij1）+（ij2）+…+（ijn-1）+（ijn））/2

式中，Pi為第i個(gè)等位基因的頻率；i為純合復(fù)等位基因；ii為第i個(gè)等位基因純合的個(gè)體數(shù)；jn為與i共顯的第n個(gè)等位基因；ijn為含有i與jn共顯性等位基因的個(gè)體數(shù)；n為1個(gè)群體內(nèi)個(gè)體的總數(shù)。由于PCR-RFLP方法的檢測(cè)結(jié)果為共顯性等位基因，因此，表型頻率即為基因型頻率?；蛐皖l率=基因型個(gè)體數(shù)/測(cè)定群體總數(shù)。

1.3.2 基因頻率和基因型頻率的差異顯著性檢驗(yàn)（χ2獨(dú)立性檢驗(yàn)）首先根據(jù)基因頻率計(jì)算各種基因型頻率的理論值，然后計(jì)算χ2。因?yàn)楸狙芯抠Y料的自由度df=1，當(dāng)基因型理論值小于5時(shí)，可采用矯正公式：

x2=■■

式中，Ei為理論值，Oi為實(shí)際觀察值，n為等位基因數(shù)。

2.3.3 H-FABP基因的純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量的計(jì)算純合度公式：

H0=■P■■

式中，Ho為某一位點(diǎn)的純合度，Pi為第i個(gè)等位基因的頻率，n為等位基因數(shù)。

雜合度計(jì)算公式：

He=1-H0 =1-■P■■

式中，He為某一位點(diǎn)的雜合度，Pi為某一位點(diǎn)上第i個(gè)等位基因頻率，n為某一位點(diǎn)的等位基因數(shù)。

有效等位基因數(shù)計(jì)算公式為：

Ne=1/H0

多態(tài)信息含量（polymorphism information content ，PIC）是由Bostein等提出的用于度量群體多態(tài)程度的指標(biāo)，一個(gè)標(biāo)記在群體中的PIC值是根據(jù)其等位基因的頻率來計(jì)算的，其公式：

PIC=1-■P■■-■■2P■■P■■

式中，n為等位基因數(shù)目；Pi和Pj分別為第i和第j個(gè)等位基因在群體中的頻率。PIC值用于對(duì)標(biāo)記基因多態(tài)性的估計(jì)，PIC>0.5為高度多態(tài)，PIC<0.25為低度多態(tài)，0.25

2 結(jié)果與分析

2.1 皖南黑豬H-FABP基因PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增結(jié)果

擴(kuò)增PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1、圖2。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段與目的片段大小一致且特異性較好，可直接進(jìn)行PCR-RFLP。

2.2 皖南黑豬H-FABP基因PCR-RFLP結(jié)果

據(jù)GenBank X98558、GenBank Y16180序列可知，H-FABP基因PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為693，816 bp。在PCR1（693 bp）擴(kuò)增片段上存在4個(gè)HinfⅠ酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生339，172，98，59，25 bp 5個(gè)片段，其中1 324 bp處為多態(tài)性酶切位點(diǎn)，當(dāng)此酶切位點(diǎn)消失時(shí)，172 bp和59 bp片段合并產(chǎn)生231 bp的片段；在PCR2（816 bp）擴(kuò)增片段上：存在3個(gè)HaeⅢ酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生405，278，117，16 bp 4 個(gè)片段，其中1 811 bp處為多態(tài)性酶切位點(diǎn)，當(dāng)此酶切位點(diǎn)消失時(shí)，278 bp和405 bp片段合并產(chǎn)生683 bp的片段；存在1個(gè)MspⅠ酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生750，66 bp 2個(gè)片段，其中在l 878 bp處為多態(tài)性酶切位點(diǎn)，當(dāng)此酶切位點(diǎn)消失時(shí)750 bp和66 bp片段合并產(chǎn)生816 bp的片段；存在3個(gè)HinfⅠ*酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生521，217，47，32 bp 4個(gè)片段，其中1 970 bp處為多態(tài)性酶切位點(diǎn)，當(dāng)此酶切位點(diǎn)消失時(shí)，217 bp和47 bp片段合并產(chǎn)生264 bp的片段。本試驗(yàn)部分個(gè)體H-FABP基因酶切結(jié)果見圖3～6。

2.3 皖南黑豬群體遺傳學(xué)分析

對(duì)皖南黑豬群體H-FABP基因3個(gè)多態(tài)酶切位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測(cè)，并計(jì)算其基因型頻率、基因頻率及Ho He、Ne、PIC值等，其結(jié)果見表2～4。

由表2可知：在皖南黑豬群體中，基因型HH、DD、AA、BB占很大優(yōu)勢(shì)，等位基因H、D、A、B分布頻率也遠(yuǎn)高于h、d、a、b。而在MspⅠ位點(diǎn)上尚未檢測(cè)到多態(tài)性，僅發(fā)現(xiàn)AA基因型，且在HaeⅢ位點(diǎn)上，只檢測(cè)到DD、Dd兩種基因型尚未發(fā)現(xiàn)dd基因型，說明了試驗(yàn)豬群H-FABP基因在這兩位點(diǎn)遺傳品質(zhì)的純合度較高；本試驗(yàn)在5-上游區(qū)和第二內(nèi)含子區(qū)均檢測(cè)到HinfⅠ多態(tài)位點(diǎn)。

由表3可知：經(jīng)χ2適合性檢驗(yàn)表明：除5-上游區(qū)HinfⅠ多態(tài)位點(diǎn)外，其他3個(gè)位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率均達(dá)到Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05），說明該群體在適應(yīng)性方面具有遺傳優(yōu)勢(shì)，并經(jīng)過長(zhǎng)期進(jìn)化和選擇達(dá)到了平衡狀態(tài)。而導(dǎo)致HinfⅠ多態(tài)位點(diǎn)未達(dá)到Hardy-Weinberg平衡的原因可能是由于皖南黑豬在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化培育過程中無意間進(jìn)行了某些人工選擇所致。

從表4可以知：693 bp、816 bp的H-FABP基因片段被HinfⅠ酶切后均表現(xiàn)多態(tài)，兩位點(diǎn)Ho分別為0.529 9，0.659 7，He分別為0.470 1，0.340 3，

Ne分別為1.887 1，1.515 8，PIC分別為0.359 6，

0.282 4，均屬中度多態(tài)。因此，該試驗(yàn)結(jié)果在一定程度上可作為有效的遺傳標(biāo)記用于該群體遺傳資源評(píng)價(jià)的建議性指標(biāo)；HaeⅢ位點(diǎn)上，Ho為0.859 4，He為0.140 6，Ne為1.163 6，PIC為0.130 7，屬低度多態(tài)；由于MspⅠ位點(diǎn)未檢測(cè)到多態(tài)，因此其Ho為1，He為0，Ne為1，PIC為0。導(dǎo)致HaeⅢ、MspⅠ這兩位點(diǎn)結(jié)果的原因可能是：（1）本試驗(yàn)豬群處在一個(gè)封閉的環(huán)境中，較少有外界其他豬種血緣的進(jìn)入，并通過長(zhǎng)期的群體內(nèi)部自然近交，使得有利基因不斷純化，同時(shí)也使一些等位基因發(fā)生了丟失，從而導(dǎo)致其PIC的降低；（2）這兩個(gè)基因座比較保守；（3）本試驗(yàn)樣本量較小所致。

2.4 皖南黑豬H-FABP基因測(cè)序結(jié)果

將測(cè)序結(jié)果與豬H-FABP基因DNA序列（GenBank，登錄號(hào)為X98558、Y16180）進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示：在5-上游區(qū)，所擴(kuò)增的693 bp的片段1 324 bp處發(fā)生T—C突變，從而形成兩個(gè)等位基因H和h（圖7）；在第二內(nèi)含子，所擴(kuò)增的816 bp的片段1 811 bp處發(fā)生G—C突變，從而形成兩個(gè)等位基因D和d（圖8）；而在1 489 bp處尚未發(fā)現(xiàn)多態(tài)突變位點(diǎn)，其測(cè)序結(jié)果如圖9所示；在1 970 bp處發(fā)生C—T突變，從而形成兩個(gè)等位基因B和b（圖10）。

3 討論

Gerbens等[8-9]利用限制性內(nèi)切酶HinfⅠ、HaeⅢ和MspⅠ對(duì)荷蘭長(zhǎng)白豬、杜洛克、大白、漢普夏、梅山、皮特蘭和野豬的H-FABP基因5-上游區(qū)和第二內(nèi)含子區(qū)進(jìn)行PCR-RFLP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，除梅山豬和漢普夏豬未檢測(cè)到HaeⅢ和MspⅠ多態(tài)位點(diǎn)外，其他豬種均檢測(cè)到3個(gè)酶切多態(tài)位點(diǎn)。龐衛(wèi)軍等[13]的研究表明在HaeⅢ和MspⅠ多態(tài)位點(diǎn)上，所檢測(cè)的榮昌豬、內(nèi)江豬和八眉豬在這兩位點(diǎn)上均無多態(tài)性，并認(rèn)為中國(guó)地方品種豬在這兩位點(diǎn)上多態(tài)型缺乏，地方品種內(nèi)IMF的差異主要是由于5-上游區(qū)HinfI多態(tài)位點(diǎn)的不同基因型所致。張桂香等[14]通過研究發(fā)現(xiàn)，北京黑豬、二花臉豬、金華豬、小梅山豬、皖南花豬、滇南小耳豬、香豬、榮昌豬和大白豬中均存在一個(gè)HinfⅠ多態(tài)位點(diǎn)，且均未發(fā)現(xiàn)MspⅠ多態(tài)位點(diǎn)，而HaeⅢ多態(tài)位點(diǎn)僅出現(xiàn)在皖南花豬和大白豬中，該研究首次報(bào)道了在皖南花豬H-FABP基因第二內(nèi)含子區(qū)中存在Hinf*多態(tài)位點(diǎn)。本試驗(yàn)在皖南黑豬中驗(yàn)證了H-FABP基因5-上游區(qū)HinfⅠ和第二內(nèi)含子區(qū)HaeⅢ多態(tài)位點(diǎn)，而在第二內(nèi)含子區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)MspⅠ多態(tài)位點(diǎn)。另外，本試驗(yàn)還在第二內(nèi)含子區(qū)中檢測(cè)到了Hinf*Ⅰ多態(tài)位點(diǎn)。該結(jié)果與張桂香的報(bào)道的研究結(jié)果基本一致。在HaeⅢ位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果中，本試驗(yàn)豬群與中國(guó)其他地方品種豬的檢測(cè)結(jié)果有一定的差異，而與張桂香檢測(cè)的皖南花豬基本一致，產(chǎn)生這一結(jié)果可能原因是：（1）皖南花豬和皖南黑豬主要分布于皖南山區(qū)，其地理位置、氣候條件和生長(zhǎng)環(huán)境相近，進(jìn)而使得這兩個(gè)地方品種豬的檢測(cè)結(jié)果一致；（2）由于研究群體的遺傳背景不同所致；（3）與本研究所選用的群體規(guī)模較小有關(guān)。本試驗(yàn)只發(fā)現(xiàn)兩種基因型DD、Dd尚未發(fā)現(xiàn)基因型dd，是否存在另外一種基因型尚需進(jìn)一步擴(kuò)大試驗(yàn)規(guī)模進(jìn)行驗(yàn)證。

國(guó)內(nèi)外研究表明：在豬H-FABP基因中，3種內(nèi)切酶（HinfⅠ， HaeⅢ， MspⅠ）所檢測(cè)的每一種PCR-RFLP，其純合基因型間IMF含量差異顯著，且aaddHH型（MspⅠ-a， HaeⅢ-d， HinfⅠ-H）具有最高的IMF含量[8-9，13]。國(guó)外品種豬肉的IMF含量較低，為2%左右，只有杜洛克豬的IMF含量相對(duì)較高。我國(guó)地方豬種的IMF含量一般處于中等到豐富的水平之間（3%～7%）[15]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，皖南黑豬H-FABP基因在5-上游區(qū)Hinf I-位點(diǎn)上表現(xiàn)出豐富多態(tài)性。HinfI多態(tài)位點(diǎn)位于5-上游區(qū)域，可能由于該區(qū)域的變異影響H-FABP基因的表達(dá)，進(jìn)而影響IMF的含量[9-10]。另外，4個(gè)位點(diǎn)的基因頻率A、D、H和B占有明顯優(yōu)勢(shì)，這一試驗(yàn)結(jié)果也可能與皖南黑豬作為脂肪型豬IMF含量較高有關(guān)。

H-FABP基因位于6號(hào)染色體上，其可能的連鎖順序?yàn)椋篠0035-[11.7]-SW2406-[29.9]-SW1057-[29.6]- S0220-[12.7]-SW316-[5.1]-HABP-[11.5]-S0003-[51.3]- SW2419[9]，這一染色體區(qū)域被認(rèn)為是影響脂肪性狀的QTL區(qū)域。在該染色體上還定位了激素敏感脂肪酶基因（HSL）[16]、磷酸葡萄糖脫氫酶基因（PGD）[17]等基因，這兩個(gè)基因多態(tài)性與豬的背膘厚、眼肌面積顯著相關(guān)[18-19]。此外，豬瘦素受體基因（LEPR）也定位于該染色體上，該基因可能是影響脂肪性狀的一個(gè)潛在的候選基因[20]。上述幾個(gè)基因間是否存在連鎖及相互之間的關(guān)系如何目前尚不清楚。因此，需聯(lián)合更多相關(guān)的候選基因或DNA 標(biāo)記來進(jìn)行分析，尋求與IMF沉積緊密連鎖的遺傳標(biāo)記，并進(jìn)一步確定H-FABP不同基因型與IMF 的關(guān)系，以便在動(dòng)物育種實(shí)踐的標(biāo)記輔助選擇（MAS）中發(fā)揮遺傳改良的作用。另外，值得注意的是H-FABP本身是牛、鼠、人培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制因子[21]，H-FABP的變異情況是否是造成皖南黑豬體型小，生長(zhǎng)緩慢的原因之一尚有待研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過對(duì)皖南黑豬H-FABP基因5-上游區(qū)和第二內(nèi)含子區(qū)變異位點(diǎn)的確切位置及引起變異原因的分析，確定了4個(gè)變異酶切位點(diǎn)的位置和突變的堿基序列。這為進(jìn)一步開展皖南黑豬肉質(zhì)性狀分子育種提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為繼續(xù)研究該基因的不同區(qū)域，尋找更多的多態(tài)性及確定影響IMF沉積的主效基因奠定理論基礎(chǔ)。

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