降解β—胡蘿卜素葡萄球菌的化學(xué)合成培養(yǎng)基研究

賀靜+朱明明+王樹(shù)林+樊明濤

摘 要：以沙棘汁中分離的降解β胡蘿卜素葡萄球菌為材料，在完全合成培養(yǎng)基中采用單一成分缺失的方法確定了菌體生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求，試驗(yàn)結(jié)果表明，精氨酸、亮氨酸、色氨酸、蘇氨酸、豐胱氨酸、脯氨酸6種氨基酸和K2HPO4和NaNO3兩種無(wú)機(jī)鹽是必需營(yíng)養(yǎng)素，其他組分或是對(duì)菌體生長(zhǎng)沒(méi)有作用，或是盡管對(duì)菌體生長(zhǎng)有一定的作用，但缺失時(shí)對(duì)菌體生長(zhǎng)不會(huì)受到較大影響。

關(guān)鍵詞：沙棘；降解β胡蘿卜素葡萄球菌；化學(xué)合成培養(yǎng)基；單一成分缺失法

中圖分類號(hào)：TS201.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.01.002

Research on Chemically Defined Medium for β-Carotene-Degrading Staphylococcus sp.

HE Jing1， ZHU Ming-ming1， WANG Shu-lin2， FAN Ming-tao1

（1. College of Food Science and Engineering， Northwest A&F University， Yangling， Shaanxi 712100， China； 2. Agriculture and Animal Husbandry College， Qinghai University， Xining， Qinghai 810016， China）

Abstract： The β-carotene - degrading Staphylococcus sp. was screened from sea-buckthorn，and the nutritional requirements of the Staphylococcus growth by single components deficiency analysis in chemically defined medium were determined. The results showed that the six amino acids Arg， Leu， Trp， Thr， Cys， Pro and two inorganic salts K2HPO4， NaNO3 were essential for chemically defined medium. Other components had lower impact on chemically defined medium and were nonessential.

Key words： sea-buckthorn；β-carotene-degrading Staphylococcus sp.；chemically defined medium；single components deficiency analysis

收稿日期：2013-10-14；修訂日期：2013-10-25

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171728；31060225）

作者簡(jiǎn)介：賀靜（1990—），女，陜西西安人，在讀碩士生，主要從事食品生物技術(shù)研究。

通訊作者簡(jiǎn)介：樊明濤（1963—），男，陜西富平人，教授，博士，主要從事食品微生物及食品安全研究。

沙棘又名黑刺、酸刺，因果實(shí)中含有豐富的維生素、類胡蘿卜素、礦物元素、氨基酸和生物活性物質(zhì)被稱為“天然維生素之王” [1-3]。沙棘廣泛分布在中國(guó)西北、西南，以沙棘果為原料釀造而成的沙棘果酒，具有增強(qiáng)毛細(xì)血管新陳代謝和延緩人體衰老的功能，長(zhǎng)期飲用能健胃補(bǔ)脾、抑制心血管疾病的發(fā)生，起到抗癌和抗衰老的作用[4-5]。沙棘酒最大的缺陷是香味寡淡，酒香不協(xié)調(diào)，而沙棘含有豐富的β-胡蘿卜素，β-胡蘿卜素在微生物酶的作用下，可以降解產(chǎn)生小分子的酮如氧化異佛爾酮、β-大馬酮、β-紫羅蘭酮、假紫羅蘭酮和二氫獼猴桃內(nèi)酯等[6-9]，這些化合物都是構(gòu)成沙棘酒香味的重要物質(zhì)[10-11]。

本研究在釀酒過(guò)程中分離出一株可以降解β-胡蘿卜素的細(xì)菌，經(jīng)初步鑒定是葡萄球菌，用天然培養(yǎng)基培養(yǎng)該菌，生長(zhǎng)良好。但是由于天然培養(yǎng)基含有酵母浸粉，其高粘性不利于后續(xù)酶的分離純化，并且酵母浸粉的組成成分不明確，影響進(jìn)一步了解微生物的生命活動(dòng)及其代謝過(guò)程[12-15]。所以，有必要優(yōu)化出一種合成培養(yǎng)基，它既不影響菌的生長(zhǎng)，又便于對(duì)降解過(guò)程產(chǎn)生的酶的研究。本研究的目的在于篩選一種適合于該菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的化學(xué)合成培養(yǎng)基，從而為類胡蘿卜素降解酶的代謝調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌種 葡萄球菌（Staphylococcus sp.）TS-82，本實(shí)驗(yàn)室分離篩選。

1.1.2 儀器與設(shè)備 UV-3802型比例雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；恒溫振蕩器，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，Sartorius 標(biāo)準(zhǔn)型PB-10 pH計(jì)、電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司； DH-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京科偉永興儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基為改良察氏培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基是在本實(shí)驗(yàn)室麻俊俠[13]的研究基礎(chǔ)上優(yōu)化得到的，不同培養(yǎng)基的成分及配方如表1所示。

1.3 菌種培養(yǎng)及測(cè)定

分別取制備好的培養(yǎng)基50 mL置于100 mL的滅菌三角瓶中，將保藏菌種接種于天然培養(yǎng)基A，在37 ℃、130 r·min-1的搖床上振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，之后將此菌液按5%的體積比接種于合成培養(yǎng)基B，采用UV-3802型比例雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其在培養(yǎng)基生長(zhǎng)的最大生物量，以未接種的培養(yǎng)基作為空白。培養(yǎng)完成后，培養(yǎng)液在4 ℃、8 000 r·min-1離心20 min，得到粗酶液，用于測(cè)定降解能力。

1.4 β-胡蘿卜素儲(chǔ)備液的制備

在避光條件下，將5 mg β-胡蘿卜素溶于10 mL的二氯甲烷中，待β-胡蘿卜素徹底溶解后加入1 g吐溫-80，使二氯甲烷完全揮發(fā)，再加入50 mL無(wú)菌蒸餾水混勻，得橘黃色、清澈的儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱中待用。

1.5 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及含量測(cè)定

分別取β-胡蘿卜素儲(chǔ)備液0，20，40，60，80，100，

120，140 μL，加蒸餾水至3.25 mL，以蒸餾水做空白，于460 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，用所得數(shù)據(jù)作圖可得β-胡蘿卜素溶液濃度與吸光度的線性關(guān)系，濃度與吸光度的線性關(guān)系式：

y =14.97x-0.173 （R2=0.990）

式中，x為β-胡蘿卜素水溶液的吸光度，y為β-胡蘿卜素在水溶液中的濃度（μmol·L-1）。

1.6 化學(xué)合成培養(yǎng)基單一成分缺失試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在化學(xué)合成培養(yǎng)基B中每次去掉其中一種物質(zhì)得到單一成分缺失培養(yǎng)基，并培養(yǎng)菌種。若缺失培養(yǎng)基上菌種生長(zhǎng)良好，則該物質(zhì)并不是必須營(yíng)養(yǎng)，反之則為必須營(yíng)養(yǎng)素。利用分光光度法，以未加入β-胡蘿卜素儲(chǔ)備液的粗酶液作為空白對(duì)照。在光程為1 cm的玻璃比色皿中加入3 mL的粗酶液（提前在37 ℃的水浴中保溫），并加入0.2 mLβ-胡蘿卜素儲(chǔ)備液，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)測(cè)定460 nm的吸光值，前20 min每隔4 min測(cè)定一次吸光值，隨后每隔5 min測(cè)定一次吸光值，測(cè)定55 min內(nèi)β-胡蘿卜素的降解量。在單一成分缺失（氨基酸，無(wú)機(jī)鹽）培養(yǎng)基中，研究β-胡蘿卜素的降解效果，判斷該缺失成分為必需營(yíng)養(yǎng)素、半必需營(yíng)養(yǎng)素還是非必需營(yíng)養(yǎng)素。以上所有試驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)平行，結(jié)果以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基上的菌種培養(yǎng)

由圖1可以看出，合成培養(yǎng)基與天然培養(yǎng)液菌體生長(zhǎng)狀況基本一致，都適合該菌的生長(zhǎng)，且12 h菌體最為豐富，試驗(yàn)時(shí)取12 h菌液離心得粗酶。

2.2 合成培養(yǎng)基中氨基酸的篩選

合成培養(yǎng)基中的氨基酸分為酸性氨基酸（谷氨酸，天冬氨酸），堿性氨基酸（賴氨酸、精氨酸、組氨酸），芳香族脂肪酸（苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸），含羥基或巰基或亞氨基的氨基酸（絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、脯氨酸），脂肪族氨基酸（丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、纈氨酸），在缺失不同氨基酸與完全合成培養(yǎng)基的條件下得到粗酶液，粗酶液降解胡蘿卜素情況如圖2所示。圖2是在缺失酸性氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸）與完全合成培養(yǎng)基的條件下粗酶液的降解曲線。

由圖2可以看出，缺失谷氨酸和天冬氨酸的粗酶液對(duì)β-胡蘿卜素的降解與完全培養(yǎng)基中獲得的粗酶液差異很小。因此，可以推斷化學(xué)合成培養(yǎng)基中添加谷氨酸和天冬氨酸菌的生長(zhǎng)以及產(chǎn)生β-胡蘿卜素酶沒(méi)有直接的關(guān)系，所以谷氨酸和天冬氨酸是非必需的氨基酸。

圖3是在缺失堿性氨基酸（賴氨酸、精氨酸、組氨酸）與完全合成培養(yǎng)基的條件下粗酶液的降解曲線。從圖3可以看出缺失精氨酸的粗酶液幾乎沒(méi)有降解β-胡蘿卜素的能力，從而可以很容易得到精氨酸是菌體生長(zhǎng)所必需的氨基酸；缺失組氨酸、賴氨酸的粗酶液降解β-胡蘿卜素的能力雖然在前20 min不及完全合成培養(yǎng)基，但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，降解效果和完全培養(yǎng)基沒(méi)有明顯差異，所以這兩種氨基酸對(duì)菌的生長(zhǎng)以及降解酶的產(chǎn)生也沒(méi)有太大的作用。

圖4是在缺失芳香氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸）與完全合成培養(yǎng)基的條件下粗酶液的降解曲線。由圖4得知缺失色氨酸的粗酶液幾乎沒(méi)有降解β-胡蘿卜素的能力，即色氨酸是必需營(yíng)養(yǎng)素；而缺失酪氨酸的粗酶液能夠降解β-胡蘿卜素，但是降解的速度較慢；缺失苯丙氨酸的培養(yǎng)基的粗酶液的降解率和完全合成培養(yǎng)基的很相近。

圖5是在缺失含羥基或巰基或亞氨基的氨基酸（絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、脯氨酸）與完全合成培養(yǎng)基的條件下菌株的生長(zhǎng)曲線，由圖5可以得出缺失蘇氨酸和胱氨酸，脯氨酸粗酶液對(duì)胡蘿卜素降解能力很弱；而蛋氨酸和絲氨酸的缺失同完全合成培養(yǎng)基降解情況相似。

圖6是在缺失脂肪族類（丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、纈氨酸）與完全合成培養(yǎng)基的條件下菌株的生長(zhǎng)曲線。由圖6可以看出，缺失亮氨酸的粗酶液能夠降解β-胡蘿卜素，但是其降解速度與完全合成培養(yǎng)基相比較慢；缺失結(jié)氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸對(duì)粗酶液會(huì)產(chǎn)生一定的影響，但是影響不是很大。

在不同氨基酸缺失的條件下根據(jù)胡蘿卜素降解情況確定了氨基酸的種類，結(jié)果如表2所示。

根據(jù)胡蘿卜素降解情況確定了必需氨基酸是Arg、Leu、Trp、Thr、Cys、Pro，半必須氨基酸是Tyr，這為培養(yǎng)基的進(jìn)一步優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。

2.3 合成培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的篩選

在確定氨基酸的種類后，有必要對(duì)無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行篩選，本實(shí)驗(yàn)對(duì)合成培養(yǎng)基中的MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、KCl、NaNO3、K2HPO4共5種無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可以看出，缺失NaNO3和K2HPO4的粗酶液降解β-胡蘿卜素的能力很差，幾乎沒(méi)有降解；而缺失MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和KCl的粗酶液的酶活也都有所降低。說(shuō)明NaNO3和K2HPO4是合成培養(yǎng)基中必需的無(wú)機(jī)鹽，對(duì)培養(yǎng)基的影響較大，其他無(wú)機(jī)鹽影響相對(duì)較小。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在該降解β胡蘿卜素的葡萄球菌化學(xué)培養(yǎng)基中，必需氨基酸為精氨酸、亮氨酸、色氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、脯氨酸；半必需氨基酸為酪氨酸；非必需氨基酸為谷氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸。必需無(wú)機(jī)鹽為NaNO3和K2HPO4。MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和KCl也影響β胡蘿卜的降解情況，在培養(yǎng)基中是不可以缺失的成分。

該試驗(yàn)確定了β-胡蘿卜素降解菌必需營(yíng)養(yǎng)需求，試驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)相關(guān)機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)。但是目前在只含必需成分的培養(yǎng)基中菌種生長(zhǎng)并不理想，這可能與氨基酸之間的相互作用有關(guān)，還需進(jìn)一步試驗(yàn)。

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該試驗(yàn)確定了β-胡蘿卜素降解菌必需營(yíng)養(yǎng)需求，試驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)相關(guān)機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)。但是目前在只含必需成分的培養(yǎng)基中菌種生長(zhǎng)并不理想，這可能與氨基酸之間的相互作用有關(guān)，還需進(jìn)一步試驗(yàn)。

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該試驗(yàn)確定了β-胡蘿卜素降解菌必需營(yíng)養(yǎng)需求，試驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)相關(guān)機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)。但是目前在只含必需成分的培養(yǎng)基中菌種生長(zhǎng)并不理想，這可能與氨基酸之間的相互作用有關(guān)，還需進(jìn)一步試驗(yàn)。

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