一株拮抗獼猴桃葉枯病的美麗短芽孢桿菌NF2的He-Ne激光誘變育種

付 博，李炎琪，李忠玲，馬 齊，徐升運(yùn)，高平安，段康民

(1.陜西省科學(xué)院酶工程研究所、陜西省酶工程技術(shù)中心、陜西省釀造發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，陜西西安 710600;2.西北大學(xué)西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710069;3.西北大學(xué)物理學(xué)系，陜西西安 710069)

近年來(lái)獼猴桃細(xì)菌性葉枯病成為新興的獼猴桃主要病害，其致病菌為丁香假單胞菌丁香致病變種(Pseudomonas syringae pv.Syringae)，該病原菌一般從葉片內(nèi)部開(kāi)始侵染，初期在葉片上形成水漬狀小斑點(diǎn)，隨著病情的加重發(fā)展成多角形大病斑，并且病斑的中心逐漸枯死，變?yōu)樯詈稚?，病斑的不斷擴(kuò)大造成葉片內(nèi)部大部分組織枯死，嚴(yán)重影響果樹(shù)的生長(zhǎng)及果實(shí)的品質(zhì)［1-3］。本課題組研究表明，美麗短芽孢桿菌(Brevibacillus formosus)對(duì)獼猴桃葉枯病病原菌具有較好的拮抗作用，同時(shí)對(duì)其他作物常見(jiàn)真菌性病害也具有良好的抗菌作用，這與該菌株可能產(chǎn)生的抗菌肽、胞外蛋白酶和脂肽類抗生素等活性物質(zhì)有關(guān)［4-5］。為了進(jìn)一步提高生物防治效果，對(duì)野生型菌種進(jìn)行誘變育種，選育拮抗能力更強(qiáng)的菌株具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前常用的生物育種方法主要有:誘變育種、基因重組育種和基因工程育種［4］，He-Ne激光誘變是一種高效的誘變育種新技術(shù)，激光具有能量密度高、靶點(diǎn)小、單色性和方向性好的特點(diǎn)，激光誘變當(dāng)代就可出現(xiàn)遺傳性突變。此外低能量的激光還具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量、獲得遺傳性能穩(wěn)定突變株等優(yōu)勢(shì)，因此在微生物育種中得到廣泛的應(yīng)用［5-7］。

本文以美麗短芽孢桿菌NF2為供試菌，采用He-Ne激光誘變技術(shù)，選育對(duì)獼猴桃葉枯病拮抗能力提高并能穩(wěn)定遺傳的突變株，從而提高菌種的應(yīng)用效果，為實(shí)用、新型、高效的生物菌劑的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種

美麗短芽孢桿菌(Brevibacillus formosus)NF2(GenBank登陸號(hào)KC495120)，本實(shí)驗(yàn)室分離保藏。獼猴桃葉枯病病原菌，丁香假單胞菌丁香致病變種(編號(hào)1336)(Pseudomonas syringae pv.Syringae)，購(gòu)于中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所。

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，用于菌株的培養(yǎng)［8］。

1.3 主要儀器

He-Ne激光器(功率0～30mW，波長(zhǎng)632.8 nm)，西北大學(xué)物理學(xué)系提供。SW-CJ-1F型無(wú)菌操作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，ZHWY-2102C型搖床(上海智城)。

1.4 美麗短芽孢桿菌NF2生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將菌株以5%接種量轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液，30℃，200r/min振蕩培養(yǎng)，2h為時(shí)間間隔，測(cè)定發(fā)酵液在600 nm處的吸光值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1．5 He-Ne激光誘變育種

1.5.1 誘變菌齡 根據(jù)菌株生長(zhǎng)曲線，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末、穩(wěn)定生長(zhǎng)期初的菌體作為誘變對(duì)象。

1.5.2 菌懸液的制備 取培養(yǎng)8 h的菌株發(fā)酵液，4 000 r/min離心15 min，棄上清，菌體沉淀用無(wú)菌生理鹽水制備成濃度為108cfu/mL的菌懸液［9］。

1.5.3 激光照射 取0.2 mL的菌懸液置于無(wú)菌玻璃小試管(1.0 cm×7.5 cm)，小試管置于激光束正下方，按照射時(shí)間 5min，10min，15min，20min，照射強(qiáng)度5mW，10mW，15mW，20mW，進(jìn)行組合誘變，未經(jīng)照射的作為空白對(duì)照。照射后吸取0.1mL進(jìn)行稀釋涂布，每個(gè)稀釋度3個(gè)平行，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。計(jì)算存活率:

1.5.4 拮抗能力的檢測(cè)［9］從不同照射組的平皿中分別隨機(jī)挑取30個(gè)單菌落，以未經(jīng)照射的原始菌株為對(duì)照，按相等的間距將菌種依次接種于含有獼猴桃葉枯病病原菌的培養(yǎng)平板上(每個(gè)平板點(diǎn)5個(gè))，30℃培養(yǎng)48 h，觀察原始菌株及誘變菌株的抑菌圈大小(直徑大小分別為Φ1，Φ2)，如果Φ2＞Φ1則視為正突變株，計(jì)算正突變率和拮抗效果提高率:

1.5.5 突變株的遺傳穩(wěn)定性［9-10］連續(xù)傳代培養(yǎng)至第15代，每隔一代記錄菌株的抑菌圈直徑(4個(gè)平行)，通過(guò)SPSS 16.0軟件分析菌株拮抗能力的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 美麗短芽孢桿菌NF2的生長(zhǎng)曲線

美麗短芽孢桿菌的革蘭氏染色結(jié)果見(jiàn)圖1。按1.4所述方法繪制NF2的生長(zhǎng)曲線(見(jiàn)圖2)，8h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末、穩(wěn)定生長(zhǎng)期初，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最大值，此時(shí)芽孢染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)菌體并未產(chǎn)芽孢，因此選擇菌齡為8h的菌體作為He-Ne激光誘變的研究對(duì)象。

2．2 He-Ne激光誘變結(jié)果

按照射時(shí)間 5min，10min，15min，20min，照射強(qiáng)度5mW，10mW，15mW，20mW，進(jìn)行組合誘變后，菌株的存活率和正突變率的差異較大(見(jiàn)表1)，但數(shù)據(jù)的規(guī)律性不強(qiáng)。當(dāng)照射強(qiáng)度為5mW時(shí)，菌株的存活率較高，在70%以上。正突變率也較高，其中5～15 min均為46.7%，20min為16.66%。初步得出結(jié)論，低強(qiáng)度激光照射有利于保持菌體活性，而且有利于篩選出正突變率較高的菌株。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，重新設(shè)置照射強(qiáng)度為5mW，照射 時(shí) 間 10min，15min，20min，25min，30min，35min，40min 進(jìn)行誘變(由于 5min 照射時(shí)間較短，照射誤差較大，穩(wěn)定性較差，所以驗(yàn)證試驗(yàn)中舍去了)。結(jié)果顯示(見(jiàn)圖3)，當(dāng)照射強(qiáng)度為5mW，照射時(shí)間為10min時(shí)菌株的存活率接近100%，正突變率44%，與第一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，確定菌株 NF2的最佳誘變條件為5mW、10min，計(jì)算菌株拮抗效果提高了20.63%(見(jiàn)圖4)。

圖1 美麗短芽孢桿菌NF2的革蘭氏染色Fig.1 Gram staining of Brevibacillus formosus NF2

圖2 美麗短芽孢桿菌NF2的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of Brevibacillus formosus NF2

表1 He-Ne激光誘變對(duì)菌株存活率和正突變率的影響Tab．1 The effect on survival rate and positive mutation rate of strain NF2 by He-Ne laser

圖3 低照射強(qiáng)度對(duì)菌株存活率和正突變率的影響Fig.3 The effect on survival rate and positive mutation rate of strain NF2 by low intensity irradiation

圖4 He-Ne激光誘變前后對(duì)比圖Fig.4 Contrast the difference before and after the He-Ne laser mutation

2.3 誘變后菌株的遺傳穩(wěn)定性分析

菌株在5mW，10min的He-Ne激光誘變條件下，菌體存活率最高且正突變效果最好。選擇1株誘變效果較好的菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)至第15代，每隔一代記錄菌株的抑菌圈直徑，通過(guò)SPSS 16.0軟件單因素分析菌株拮抗能力的遺傳穩(wěn)定性(見(jiàn)表2)，P=1.000(＞0.05)統(tǒng)計(jì)分析表示總體平均數(shù)差異不顯著，說(shuō)明誘變后各代間菌株的拮抗能力沒(méi)有顯著性差異，由此可以證明誘變后正突變菌株的拮抗能力可以穩(wěn)定遺傳。

表2 誘變后菌株遺傳穩(wěn)定性的單因素方差分析Tab．2 One-way ANOVA analysis on genetic stability of mutant strain

3 結(jié)論

激光作為一種新的誘變劑，對(duì)生物體會(huì)產(chǎn)生熱、壓力、光、電磁場(chǎng)等多種效應(yīng)，在微生物遺傳育種中具有廣泛的應(yīng)用前景［11］。本研究采用He-Ne激光器，對(duì)美麗短芽孢桿菌NF2進(jìn)行誘變，結(jié)果顯示菌株NF2的最佳誘變條件為5mW，10min，誘變后菌株拮抗效果提高了20.63%，說(shuō)明低劑量激光輻射更有利于菌株誘變效果的提高，這與黃建新［14］、祖威［7］等人的研究結(jié)果一致。推測(cè)這可能是由于激光誘變過(guò)程產(chǎn)生的光、熱、壓力和電磁場(chǎng)效應(yīng)，直接或間接地激活了菌體質(zhì)粒中攜帶的抗生素基因、或者激活了菌體產(chǎn)生某種酶的能力［9］。

研究顯示，誘變后菌株的拮抗能力可以遺傳穩(wěn)定至少15代，說(shuō)明He-Ne激光誘變的菌株穩(wěn)定性較好。但是，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)He-Ne激光器在5mW這樣低功率條件下，光束會(huì)有一定的能量損失，因此在操作時(shí)應(yīng)提前較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)儀器進(jìn)行預(yù)熱和光強(qiáng)度穩(wěn)定性調(diào)整。

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