木聚糖酶Xyn43A基因在大腸桿菌及畢赤酵母中的表達(dá)比較

周晨妍，劉振華，王丹丹,2，李同彪，朱新術(shù)，王燕

1(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,合成生物學(xué)改造工程與應(yīng)用實驗室，河南 新鄉(xiāng)，453003)2(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)，453003)

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木聚糖酶Xyn43A基因在大腸桿菌及畢赤酵母中的表達(dá)比較

周晨妍1*，劉振華1，王丹丹1,2，李同彪1，朱新術(shù)1，王燕1

1(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,合成生物學(xué)改造工程與應(yīng)用實驗室，河南 新鄉(xiāng)，453003)2(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)，453003)

摘要根據(jù)木聚糖酶Xyn43A基因序列，設(shè)計特異性引物，以pMD18-T-Xyn43A重組質(zhì)粒為模板克隆Xyn43A成熟肽基因，將該基因分別克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a和畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K中，分別在大腸桿菌BL21及畢赤酵母GS115中表達(dá)。重組酶在大腸桿菌中胞內(nèi)表達(dá)，比酶活力可達(dá)61.43 U/mg。重組酶在畢赤酵母中分泌表達(dá)，比酶活力可達(dá)145.24 U/mg。酶學(xué)性質(zhì)顯示，BL21-Xyn43A、GS115-Xyn43A重組酶最適溫度、pH相同均為45 ℃、pH 5.0。GS115-Xyn43A溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性均優(yōu)于BL21-Xyn43A。

關(guān)鍵詞黑曲霉；木聚糖酶；大腸桿菌；畢赤酵母；表達(dá)

木聚糖是自然界中廣泛存在的一種多糖，它的降解需要多種酶的共同參與，木聚糖酶是其中十分重要的一類酶[1]，目前已廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中[2-3]。很多微生物，例如：芽孢桿菌、酵母菌、曲霉、青霉、鐮刀菌等都可產(chǎn)生木聚糖酶[4-5]。木聚糖酶種類很多，分布于糖基水解酶GH5，7，8，10，11，16，43，52及62多個家族，目前報道的木聚糖酶主要歸屬于GH10和GH11兩大家族[6-8]，其他家族的木聚糖酶報道偏少。

我們在前期的研究過程中從實驗室保藏的黑曲霉(Aspergillusniger)XZ-3S中克隆出木聚糖酶Xyn43A基因，并對其進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析，研究發(fā)現(xiàn)它屬于糖基水解酶GH43家族，是一種新的木聚糖酶基因，Genbank登錄號為JQ700383[9]。本研究將Xyn43A基因在大腸桿菌及畢赤酵母中表達(dá)，并對重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，以期對該酶更好的結(jié)構(gòu)與功能研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒與試劑

黑曲霉(Aspergillusniger)XZ-3S，大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109、DH5α、BL21(DE3)，由作者所在實驗室保存；pMD18-T-Xyn43A重組質(zhì)粒，由作者所在實驗室構(gòu)建保存；原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a，購自Novagen公司；真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K及畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115，購自Invitrogen公司；DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、連接酶、IPTG、X-gal，購自TaKaRa公司；氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)，購自Sangon公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，購自Sangon公司；DNA Marker，購自MBI公司；溴化乙錠(Ethidium bromide)，購自Amresco公司；酵母粉、蛋白胨、瓊脂糖，購自BBI公司；G418、無氨基酵母氮源(YNB)，購自Amresco公司；樺木木聚糖購自Sigma公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純產(chǎn)品。

1.2培養(yǎng)基

大腸桿菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，具體配方見參考文獻(xiàn)[10]。畢赤酵母培養(yǎng)所用YPD、MD、BMGY、BMMY培養(yǎng)基的配方參照Invitrogen公司的畢赤酵母操作手冊。

1.3目的基因的克隆及重組表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)實驗室已克隆得到的木聚糖酶Xyn43A基因序列(Genbank:JQ700383)以及原核表達(dá)載體pET-28a、真核表達(dá)載體pPIC9K的多克隆位點，設(shè)計以下3條引物：

Y1：5′- CCGGAATTCAATCCCGTCTTCCCCGGCT-3′(EcoRⅠ酶切位點)；

Y2：5′- CCCAAGCTTCTACGATAAAGTCCTCCCCT-3′(Hind Ⅲ酶切位點)；

Z1：5′- ATAAGAATGCGGCCGCCTACGATAC￣G￣A￣T￣A￣A￣A￣G￣T￣C￣CTCC -3′(NotⅠ)，其中引物Y1、Y2擴(kuò)增產(chǎn)物用于大腸桿菌重組表達(dá)載體的構(gòu)建，引物Y1、Z1擴(kuò)增產(chǎn)物用于畢赤酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

以pMD18-T-Xyn43A重組質(zhì)粒為模板，分別以Y1/Y2，Y1/Z1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件均為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，67 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物回收后，與對應(yīng)表達(dá)載體經(jīng)雙酶切、回收、連接。用于大腸桿菌表達(dá)的連接液轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，用于畢赤酵母表達(dá)的連接液轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液分別涂布含Kan和Amp的LB平板，陽性克隆子篩選后，提取質(zhì)粒經(jīng)酶切及PCR驗證，最終獲得重組質(zhì)粒pET-28a-Xyn43A、pPIC9K-Xyn43A。

1.4目的酶的表達(dá)

1.4.1 目的酶在大腸桿菌中的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET-28a-Xyn43A轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)菌株，轉(zhuǎn)化液涂布含Kan 100 μg/mL的LB平板，所得陽性克隆子定義為BL21-Xyn43A。同時以pET-28a空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)所得BL21-pET-28a為對照菌株。將目的菌株及對照菌株的過夜液體培養(yǎng)物，分別按1∶50的接種量接于30 mL含Kan的LB培養(yǎng)基中，230 r/min振蕩培養(yǎng)3 h，待A600值達(dá)到0.6左右時，分別加入IPTG至終濃度為2.5 mmol/L，28 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h。

1.4.2目的酶在畢赤酵母中的表達(dá)

重組質(zhì)粒pPIC9K-Xyn43A經(jīng)SalⅠ酶切線性化后，電泳回收目的片段，參照Invitrogen公司操作手冊，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115。轉(zhuǎn)化液涂布MD平板，篩選出的陽性克隆子經(jīng)不同G418濃度的YPD平板初篩，搖瓶復(fù)篩，最后獲得1株重組木聚糖酶產(chǎn)量較高的菌株，記作GS115-Xyn43A。pPIC9K空載體經(jīng)上述同步操作，經(jīng)G418濃度梯度YPD平板篩選獲得的對照菌株記作GS115-pPI。分別挑取GS115-Xyn43A和GS115-pPI菌落，接種于含有30 mL BMGY培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，30 ℃，250 r/min培養(yǎng)至A600值為6.0左右，三角瓶靜置30 min，待菌體沉降后，傾去上清，沉淀菌體轉(zhuǎn)接入20 mL BMMY培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)120 h，期間每24 h補(bǔ)加100%甲醇至終濃度為2.25%。

1.5重組酶的純化

1.5.1大腸桿菌重組酶的純化

將重組大腸桿菌培養(yǎng)液10 000 r/min，離心10 min，菌體沉淀用10 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 5.0)懸浮，冰水浴中超聲波破碎菌體(超聲條件：功率400 W，間隔5 s，工作5 s，超聲40次)，超聲破碎液，12 000 r/min，離心10 min，上清液即為重組酶粗酶液。重組酶純化采用鎳金屬螯合層析柱，具體方法參見文獻(xiàn)[10]，純化后樣品檢測用SDS-PAGE電泳(5%濃縮膠和12%分離膠)。

1.5.2畢赤酵母重組酶的純化

將重組酵母培養(yǎng)液，3 000 r/min，離心10 min，取發(fā)酵上清液聚乙二醇濃縮，透析，后經(jīng)Sephadex G-75純化，純化后樣品檢測用SDS-PAGE電泳(5%濃縮膠和12%分離膠)。

1.6重組酶活力及蛋白濃度的測定

木聚糖酶活力測定，采用DNS法，具體參見文獻(xiàn)[11]。酶活力單位(U)定義：以0.5%樺木木聚糖為底物，在45 ℃、pH 5.0條件下，以每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為1U。

蛋白濃度測定采用Bradford法[12]，標(biāo)準(zhǔn)蛋白為牛血清白蛋白。

本論文重組酶活力采用比酶活力表示，比活力(U/mg)為酶活力與蛋白濃度的比值。

1.7重組酶酶學(xué)性質(zhì)的測定與比較

測定重組酶的最適作用溫度、pH值及溫度、pH值對重組酶穩(wěn)定性的影響，具體方法參見文獻(xiàn)[13]。在每一組性質(zhì)的測定中，以比酶活力最高值為100%計算各因素的相對酶活力。

1.8數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析

每個實驗進(jìn)行3次重復(fù)，取其平均值，最終實驗數(shù)據(jù)均用Excel辦公軟件和SPSS11.0軟件進(jìn)行處理，并繪制出相應(yīng)的變化曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1目的基因的克隆及重組表達(dá)載體的構(gòu)建

M-DNA Marker；1-pPIC9K-Xyn43A雙酶切產(chǎn)物；2-Y1/Z1引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3-pET28a-Xyn43A雙酶切產(chǎn)物；4-Y1/Y2引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖1　重組表達(dá)載體的PCR和酶切驗證Fig.1　Verification of recombinant plasmids by PCR and restriction analysis

以pMD18-T-Xyn43A重組質(zhì)粒為模板，以Y1/Y2為引物PCR擴(kuò)增的目的條帶及以Y1/Z1為引物擴(kuò)增的目的條帶(電泳圖譜未顯示)大小均與理論值相符。將目的條帶割膠回收后與pET-28a、pPIC9K分別酶切、回收、連接，連接液分別轉(zhuǎn)化指定感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)抗生素平板篩選的陽性克隆子，提取質(zhì)粒經(jīng)酶切與PCR驗證(圖1)，最終獲得重組質(zhì)粒pET-28a-Xyn43A、pPIC9K-Xyn43A。

2.2目的酶在大腸桿菌中的表達(dá)及純化

pET-28a-Xyn43A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)后重組木聚糖酶比酶活力可達(dá)61.43 U/mg。誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體細(xì)胞經(jīng)1×SDS上樣液煮沸裂解后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(圖2a)。重組質(zhì)粒在分子質(zhì)量34.5 kDa處有明顯條帶(圖2a泳道2)，而未誘導(dǎo)的重組菌、誘導(dǎo)的對照菌株及未誘導(dǎo)的對照菌株均未檢測到目的條帶(圖2a泳道3、4、5)。以低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，凝膠電泳經(jīng)計算機(jī)掃描，依據(jù)蛋白條帶染色的強(qiáng)度，利用Quantity One凝膠分析軟件定量分析顯示，誘導(dǎo)3 h，目的蛋白表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白量的11.3%。

(a)M-蛋白質(zhì)Marker；1-BL21-Xyn43A重組酶純化后；2-BL21-Xyn43A/IPTG；3-BL21-Xyn43A/未IPTG；4-BL21-pET/IPTG；5- BL21-pET/未IPTG；(b) M-蛋白質(zhì)Marker；1-GS115-Xyn43A重組酶純化后；2-甲醇誘導(dǎo)GS115-Xyn43A重組菌發(fā)酵上清液；3-甲醇誘導(dǎo)GS115-pPI對照菌發(fā)酵上清液圖2　SDS-PAGE電泳檢測表達(dá)產(chǎn)物Fig.2　Detection of expression products by SDS-PAGE

重組酶分子質(zhì)量略大于Xyn43A基因理論預(yù)測分子量33.47 kDa[9]，這主要是由于我們表達(dá)用的Xyn43A基因為Xyn43A的成熟肽基因，沒有起始密碼子，表達(dá)過程中利用了pET-28a的ATG密碼子，因此表達(dá)的外源蛋白融合進(jìn)了一段pET-28a序列所編碼的長度為36個氨基酸的肽段。重組酶經(jīng)鎳柱純化后(圖2a泳道1)，可用于后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)的測定。

2.3目的酶在畢赤酵母中的表達(dá)及純化

重組菌GS115-Xyn43A經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，在發(fā)酵上清液中檢測到木聚糖酶活性，木聚糖酶比酶活力可達(dá)145.24 U/mg，在同樣條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)的對照菌株GS115-pPI發(fā)酵上清液檢測不到木聚糖酶活性。SDS-PAGE電泳圖譜中重組菌GS115-Xyn43A發(fā)酵上清液目的位置相較對照菌株GS115-pPI發(fā)酵上清液顯示出特異性蛋白條帶(圖2b泳道2、3)。Quantity One凝膠分析軟件定量分析顯示，重組菌GS115-Xyn43A誘導(dǎo)120 h，目標(biāo)蛋白表達(dá)量占分泌蛋白總量的88.3%。

重組菌GS115-Xyn43A發(fā)酵液純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳(圖2b泳道1)，在33.5 kDa位置出現(xiàn)單一蛋白條帶，與理論分子質(zhì)量基本相符。電泳檢測重組酶純度滿足后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)測定的要求。

2.4重組酶酶學(xué)性質(zhì)的測定與比較

重組酶Xyn43A在大腸桿菌及畢赤酵母中表達(dá)后的最適溫度均為45 ℃(圖3)。

圖3　重組酶的最適作用溫度Fig.3　The optimal temperature of the recombinant enzymes

經(jīng)畢赤酵母表達(dá)的重組酶GS115-Xyn43A溫度穩(wěn)定性明顯好于大腸桿菌表達(dá)的重組酶BL21-Xyn43A(圖4)。在50 ℃保溫不同時間，GS115-Xyn43A酶活力變化不大；而BL21-Xyn43A在該溫度下僅保溫10 min，酶活力就下降到初始酶活力的22%。在55 ℃保溫25 min，GS115-Xyn43A酶活力為初始酶活力的55%，同等條件下BL21-Xyn43A酶活力就下降到初始酶活力的11.5%。

重組酶Xyn43A在大腸桿菌及畢赤酵母中表達(dá)后的最適pH均為pH 5.0(圖5)。pH穩(wěn)定性曲線顯示，GS115-Xyn43A在pH 3.5～pH 8.0的范圍內(nèi)保持60%的相對酶活力，此范圍略寬于BL21-Xyn43A的pH 4.0～pH 7.0(圖6)。

圖5　重組酶的最適作用pHFig.5　The optimal pH of the recombinant enzymes

圖6　重組酶的pH穩(wěn)定性Fig.6　pH stability of the recombinant enzymes

3討論

木聚糖酶作為一種重要的酶制劑，近年來，研究者對其進(jìn)行了大量研究，研究重點已經(jīng)從傳統(tǒng)的發(fā)酵產(chǎn)酶菌株發(fā)展轉(zhuǎn)向為通過各種分子生物學(xué)技術(shù)將木聚糖酶在異源的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。木聚糖酶基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)以大腸桿菌研究最多[14]。大腸桿菌繁殖速度快，是相對理想的宿主細(xì)胞，但是由于其是原核生物，細(xì)胞外存在細(xì)胞壁，必須先將細(xì)胞壁破碎后才能將目的蛋白釋放出來，而真核細(xì)胞克服了原核細(xì)胞的這一缺點，能夠?qū)⒈磉_(dá)的目的蛋白分泌到細(xì)胞外。能夠表達(dá)木聚糖酶的真核細(xì)胞以釀酒酵母和畢赤酵母作為代表[15]，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)簡單，含有強(qiáng)的啟動子，有利于外源基因在體內(nèi)的高效表達(dá)。

本研究對A.nigerXZ-3S來源的一GH43家族木聚糖酶基因Xyn43A進(jìn)行了大腸桿菌原核表達(dá)及畢赤酵母真核表達(dá)研究，Xyn43A在兩種表達(dá)體系中均獲得異源活性表達(dá)。重組酶純化后酶學(xué)性質(zhì)的差異，可能是由于畢赤酵母表達(dá)真核蛋白具有翻譯后修飾功能，而大腸桿菌作為原核生物不具備這種功能所致。

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Expression of xylanaseXyn43Agene inEscherichiacoliandPichiapastoris

ZHOU Chen-yan1*，LIU Zhen-hua1,WANG Dan-dan1,2,LI Tong-biao1,ZHU Xin-shu1,WANG Yan1

1(Synthetic Biology Remaking Engineering and Application Laboratory,School of Life Science and Technology, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China)2(School of Sanquan, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China)

ABSTRACTThe gene of Xyn43A mature peptide was amplified with a template of the recombinant plasmid pMD18-T-xyn43A and specific primers designed according to the cDNA sequence of Xyn43A from Aspergillus niger XZ-3S. It was respectively inserted into vectors of pET-28a and pPIC9K and then transformed to Escherichia coli BL21 (DE3) and Pichia pastoris GS115, respectively. The recombinant xylanase was expressed in the cytoplasm of E. coli, and the specific activity of the recombinant enzyme was 61.43 U/mg. The enzyme was extracellular secretion in P. pastoris, and its specific activity was 145.24 U/mg. The optimum temperatures and pH values of BL21-Xyn43A and GS115-Xyn43A were both 45 ℃ and pH 5.0. The temperature stability and pH stability of GS115-Xyn43A were better than those of BL21-Xyn43A.

Key wordsAspergillus niger; xylanase; Escherichia coli; Pichia pastoris; expression

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606003

基金項目：河南省科技攻關(guān)計劃項目(162102210118)；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目(13A180861)；河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計劃項目(2011GGJS-125)；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院科研項目培育基金(2013ZD113)

收稿日期：2016-01-16，改回日期：2016-03-03

第一作者：博士，副教授(本文通訊作者，E-mail:zhouchenyan2008@163.com)。