超聲水提花生粕多糖中脫蛋白方法的研究

【摘要】通過超聲水提法從花生粕中提取水溶性多糖，經(jīng)過TCA法脫蛋白、Savag法脫蛋白、Savag-酶聯(lián)用法脫蛋白方法的比較，從而確定TCA法（濃度15%）脫蛋白，蛋白質(zhì)脫除率為85.47%，多糖保留率為92.58%。

【關(guān)鍵詞】超聲水提法；多糖；花生粕；脫蛋白

本文的目的在于通過對花生粕多糖的脫蛋白技術(shù)的研究，為花生粕中營養(yǎng)成分更深入的開發(fā)利用和提高花生粕的附加值提供一定的理論依據(jù)。

1、材料與方法

1.1材料與試劑

超聲水提花生粕粗多糖，參考文獻[1]做法。

1.2多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[2]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，以葡萄糖的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，490nm處的吸光值為縱坐標(biāo)，得到葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0063x+0.0135，R2=0.9991。

1.3蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍(lán)法[3]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，以牛血清白蛋白的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，595nm處的吸光值為縱坐標(biāo)，得到蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0052x-0.0061，R2=0.9988。

1.4脫蛋白

1.4.1三氯乙酸（TCA）法[4]。取10mg/mL粗多糖6份，分別加入1/5體積的3%，5%，7%，10%，12%，15%（W/W）的TCA，充分搖勻后，放置2h，以10，000rpm離心10min，取上清液稀釋10倍，分別測定多糖和蛋白質(zhì)的含量。

1.4.2Savag法[5]。取10mg/mL粗多糖7份，設(shè)脫蛋白1、2、3、4、5、6、7次7個處理，每次加入1/3體積的Savag試劑（氯仿：正丁醇=4：1（V/V）），充分搖勻后，放置2h，以10，000rpm離心10min，取上清液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，分別測定多糖和蛋白質(zhì)的含量。

1.4.3Savag-酶聯(lián)用法。取10mg/mL粗多糖3份，加入0.15%（m/V）木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值到6.5左右，在50℃水浴條件下酶解2h，再用Savag法分別脫蛋白1、2、3次，充分搖勻后，放置2h，以10，000rpm離心10min，取上清液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，分別測定多糖和蛋白質(zhì)的含量。

2、結(jié)果與分析

2.1三種脫蛋白方法的比較及選擇

2.1.1三氯乙酸（TCA）法。三氯乙酸脫蛋白的原理是使樣品中的蛋白質(zhì)在有機酸作用下變性而沉淀出來，不同濃度的三氯乙酸對蛋白質(zhì)和多糖的一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)均有不同的影響。從圖1中發(fā)現(xiàn)，在三氯乙酸濃度在3～10%，蛋白質(zhì)的脫除率是越來越高的，多糖的保留率是越來越小的，但是當(dāng)三氯乙酸濃度超過10%，多糖的保留率又有所回升，這說明過高濃度的三氯乙酸對多糖的破壞此時有所減小，可能是由于高濃度的三氯乙酸破壞了與蛋白質(zhì)相連接的多糖的糖苷鍵，使得斷裂糖苷鍵后的多糖被釋放出來，從而使得多糖的保留率有少許的升高。綜合考慮這些因素，選擇15%的三氯乙酸作為PPMU的蛋白脫除劑。

2.1.2Savag法。用Sevag法脫除蛋白質(zhì)，隨著處理次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)的脫除率是逐漸增大的，但是如此同時，多糖的保留率是逐漸減小的，這就說明Sevag試劑對蛋白質(zhì)和多糖都起到了破壞的作用。如圖2中所示，可以看出隨著處理次數(shù)的增加，多糖和蛋白質(zhì)含量均在減少，但在第5次處理后，粗多糖溶液中蛋白質(zhì)和多糖的含量趨向于穩(wěn)定，可以說明Sevag法脫蛋白主要是集中在前5次，而后幾次基本上對蛋白質(zhì)脫除作用不大。在Sevag法脫蛋白的過程中，需反復(fù)處理，每次除去的蛋白質(zhì)變性膠狀物中，難免會溶有少量多糖，而且糖蛋白的復(fù)合物在處理時也會沉淀下來，造成了多糖的損失。還可以看出，同三氯乙酸法比較起來，Sevag法的脫蛋白效果不佳，每次只能除掉小部分的蛋白質(zhì)，而且每次都伴隨著有多糖的損失，如果經(jīng)過多次處理，多糖必定會大量的損失，因此綜合以上的考慮，采用Sevag法對PPMU脫蛋白并不合適。

2.1.3Savag-酶聯(lián)用法。經(jīng)過木瓜蛋白酶處理后，由于絕大部分游離蛋白及部分與多糖結(jié)合的蛋白被水解。從圖3來看，使用酶法-Sevag聯(lián)用法來脫蛋白比起單獨使用Sevag法，能夠大大的節(jié)約Sevag試劑的用量，降低多糖損失。但是從圖中還可以看出，木瓜蛋白質(zhì)的專一性不是很好，經(jīng)過酶處理后的粗多糖溶液中還有一定量的蛋白質(zhì)，而且再使用Sevag法也不能達到很好的脫蛋白效果。

2.1.4不同脫蛋白方法效果比較

從表1中可以看出，TCA法對PPMU的脫蛋白效果是最好的，酶-Sevag法次之，Sevag法是最差的。而且TCA法比它2種方法，具有操作簡單，結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點，而且多糖提取液中的少量色素也易隨著蛋白沉淀而被除去，能夠減輕后續(xù)操作的難度。綜合考慮以上這些因素，采用TCA法對PPMU進行脫蛋白。

3、結(jié)論

比較了三種方法的脫蛋白效果，選擇TCA法（濃度15%）脫蛋白，此時蛋白損失率較高，多糖的損失率較少。