阿托伐他汀對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠左室肥厚的影響及其可能機(jī)制

蒲麗君 趙珂 羅勇

[摘要]目的應(yīng)用阿托伐他汀抑制白發(fā)性高血壓大鼠出現(xiàn)左室肥厚心肌過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）和p21表達(dá)及其改善機(jī)制。方法隨機(jī)將同批次16只具有8周齡的自發(fā)性高血壓大鼠分為阿托伐他汀ATV組與白發(fā)性高血壓SHR組（各8只）；另選取8只同周齡大鼠作為正常血壓WKY組。采用阿托伐他汀對(duì)ATV組進(jìn)行灌胃，50mg/（kg·d）；對(duì)SHR組與WKY組進(jìn)行等容量蒸餾水灌胃，測(cè)量3組大鼠血壓，5周/次；持續(xù)干預(yù)10周后，對(duì)其血壓及血脂水平進(jìn)行觀察與測(cè)量，同時(shí)計(jì)算其心肌肥厚指標(biāo)，并使用RT-PCR、免疫組化觀察PPARγ和p21的表達(dá)。結(jié)果血脂及血壓觀測(cè)結(jié)果顯示，SHR組與ATV組無顯著差異，ATV組心肌肥厚指標(biāo)明顯低于SHR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；ATV組PPARγ和p21的表達(dá)明顯高于SHR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。心肌組織PPARγ和p21 mRNA的表達(dá)表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性。結(jié)論阿托伐他汀可白行對(duì)白發(fā)性高血壓大鼠心肌細(xì)胞中PPARγ、p21上調(diào)以對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)節(jié)，對(duì)高血壓左室肥厚具有改善作用。

[關(guān)鍵詞]激活受體γ；p21；自發(fā)性高血壓大鼠：左室肥厚；阿托伐他汀

[中圖分類號(hào)]R544.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1674-0742（2015）07（c）-0012-04

心血管疾病常見病之一高血壓，其心臟彩超顯示心臟由于長(zhǎng)期受壓超負(fù)荷下為左心室肥厚，同時(shí)左室肥厚也是心臟終末心衰發(fā)展過程的共同基礎(chǔ)，同時(shí)也是引發(fā)高血壓患者出現(xiàn)嚴(yán)重心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素。參與這一病理生理過程的因素較為多樣且復(fù)雜，常規(guī)除去高血壓的影響外，細(xì)胞的增殖與凋亡失衡也與其關(guān)系密切。多種蛋白及基因?qū)?xì)胞的增殖與凋亡進(jìn)行調(diào)控。其中過氧化物酶體增值物激活受體γ（PPARγ）是細(xì)胞分化過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，主要參與脂質(zhì)及糖代謝，并在細(xì)胞增殖凋亡過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，其在高血壓發(fā)展與左室肥厚的關(guān)系探究中具有重要觀察意義。p21可促導(dǎo)細(xì)胞的增殖與分化，其實(shí)增殖細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。他汀類藥物除具有調(diào)節(jié)血脂的作用外還能夠發(fā)揮心血管保護(hù)效應(yīng)，大量研究表明阿托伐他汀可抑制膠原蛋白的合成，有抗氧化、抗炎的作用，使其可以對(duì)高血壓左室肥厚進(jìn)行干預(yù)和影響。但有關(guān)基因PPARγ、p21是否參與其中目前研究較少。該研究于2014年8月12日-2014年10月14日以SHR為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停接懓⑼蟹ニ?、高血壓左室肥厚以及PPARγ、p21之間的聯(lián)系和影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

實(shí)驗(yàn)開始于2014年8月12日，歷時(shí)10周到2014年10月14日結(jié)束。24只大鼠均于重慶藤清生物技術(shù)有限公司購(gòu)入，其中16只同批次的SHR、ATV以及8只WKY大鼠，均為體重在120～150g的8周齡雄性大鼠，清潔級(jí)。將16只8周齡白發(fā)性高血壓大鼠隨機(jī)分為兩組各8只，分別為阿托伐他汀組（ATV組）與白發(fā)性高血壓對(duì)照組（SHR組）；另選取8只同周齡大鼠作為正常血壓WKY組。對(duì)ATV組進(jìn)行阿托伐他?。ㄝx瑞制藥有限公司）灌胃，50mg/（kg-d）；對(duì)SHR組與WKY組進(jìn)行等容量蒸餾水灌胃，測(cè)量3組大鼠血壓，5周欣；持續(xù)干預(yù)10周后，每隔5周測(cè)1次血壓。10周后，觀察大鼠血壓、血脂水平，計(jì)算心肌肥厚指標(biāo)，采用免疫組化及RT-PCR觀察PPARγ和p21的表達(dá)。

1.2 血壓測(cè)定

采用尾袖法無創(chuàng)式測(cè)大鼠血壓，從第八周齡開始，每5周測(cè)血壓1次。

1.3 左室質(zhì)量指數(shù)

10周后大鼠空腹稱取體重（BW），使用2.5%戊巴比妥鈉進(jìn)行注射麻醉，劑量50mg/kg，腹主動(dòng)脈抽取2ml血液進(jìn)行檢測(cè)，分別檢測(cè)TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。將大鼠心臟取出吸干并稱其重量（HW），并分離出左心室（包括室間隔），沖洗及吸干后稱取左心重（LVW）；計(jì)算心臟重量與體重的比值（HW/BW）以及左心室重點(diǎn)與體重的比值（LVW/BW），并以此作為判斷心肌肥厚的指標(biāo)。白心尖部取心肌組織約4mm放入10%甲醛內(nèi)固定，用于制備組織蠟塊。剩余左心室組織保存于-80℃冰箱內(nèi)用于提取RNA。

1.4 血脂測(cè)定

將采集的腹主動(dòng)脈血離心分離得到血清，采用Hitachi全自動(dòng)化學(xué)分析儀測(cè)定血清中TC、TG、LDL-C及HDL-C的水平。

1.5 心肌組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

將石蠟包埋的心肌組織用石蠟冰凍切片機(jī)（LEICA SM2500E）切片，厚度為4μm，HE染色，電子顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)。

1.6 心肌細(xì)胞p21、PPARγ的分布

嚴(yán)格按照SABC試劑盒說明書進(jìn)行操作。使用由美國(guó)SantaCruz公司生產(chǎn)的鼠抗鼠p21單克隆抗體以及鼠抗鼠PPARγ單克隆抗體作為一抗；由中國(guó)武漢博士德生物工程公司生產(chǎn)的羊抗鼠IgG作為二抗。光學(xué)顯微鏡下顯示，心肌細(xì)胞正常狀態(tài)下呈藍(lán)色細(xì)胞核，p21、PPARγ的表達(dá)呈棕色（+）。每只大鼠均隨機(jī)抽取5張切片在x400的高倍鏡下觀察陽(yáng)性心肌細(xì)胞所占比例，計(jì)算其蛋白的表達(dá)率。

1.7 心肌組織p21、PPARγ mRNA表達(dá)水平

取100mg心肌細(xì)胞標(biāo)本，采用TRIzol法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行總RNA提取，并使用UV-2500紫外線分光光度計(jì)算RNA純度，取2μg總RNA根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，制備cDNA，作為PCR反應(yīng)的模板。使用中國(guó)上海生工生物工程公司合成的引物具體見表1。在94℃溫度下預(yù)變5min，后進(jìn)入30個(gè)循環(huán)。預(yù)變過程：預(yù)變30s后溫度降至56℃退火，30s，溫度升至72℃延伸30s.最后溫度定為74℃延伸5min。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR終產(chǎn)物8μL，時(shí)間約40min，采取凝膠成像儀對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行分析，計(jì)算基因、GAPDH的灰度比作為mR-NA的表達(dá)相對(duì)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS 17.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x+s）表示，多組間變量的比較采用單因素方差法分析，以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Spearman相關(guān)分析PPARγ和p21mRNA的表達(dá)與心肌肥厚指標(biāo)的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 阿托伐他汀藥物對(duì)血壓、血脂水平的影響

ATV組和SHR組的血壓均顯著高于WKY組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而ATV組和SHR組兩組間的血壓，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>O.05），見表2。10周后，ATV、SHR兩組血脂水平均明顯低于WKY組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在阿托伐他汀干預(yù)后ATV組血脂水平與SHR組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表3。

2.2 阿托伐他汀藥品對(duì)心肌肥厚指數(shù)的影響

對(duì)比發(fā)現(xiàn)，SHR組大鼠HW/BW、LVW/BW明顯高于WKY組大鼠；ATV組上述指標(biāo)均降低且與SHR組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但并未降至正常水平，與WKY組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），具體結(jié)果見表3。

2.3 心肌組織的光鏡下觀察

WKY組：形態(tài)正常，排列整齊，無明顯肥大；SHR組：形態(tài)異常、排列紊亂，明顯肥大，部分心肌纖維出現(xiàn)斷裂；ATV組：介于WKY、SHR兩組之間，形態(tài)及排列較SHR組相比較為整齊規(guī)則，心肌纖維斷裂較少，細(xì)胞肥大較少。見圖1。

2.4 免疫組化檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示：p21、PPARγ蛋白均在大鼠心肌細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，SHR組和ATV組PPARγ和p21蛋白的（+）表達(dá)率均低于WKY組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；ATV干預(yù)后，PPARγ和p21的（+）表達(dá)率明顯上升，ATV組高于SHR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2、圖3。

A：WKY組；B：SHR組：C：ATV組。表達(dá)（+）的心肌細(xì)胞核呈棕黃色（如白色箭頭所示），表達(dá)（一）的心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色（如黑色箭頭所示）

2.5 RT-PCR結(jié)果

結(jié)果顯示：SHR、ATV兩組大鼠p21、PPARγ mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于WKT組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；ATV干預(yù)后，p21、PPARγ mRNA的表達(dá)均上升，ATv組高于SHR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖4、表4。

2.6 p21、PPARγ mRNA與心肌肥厚相關(guān)性

p21 mRNA的表達(dá)與HW/BW、LVW/BW均呈高度負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=-0.708、-0.667，P

3 討論

高血壓可使心肌肥厚、心室重構(gòu)，是對(duì)心臟損傷的表現(xiàn)之一，也是引起心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究表明，他汀類藥物除降脂外還可干預(yù)細(xì)胞周期，以此對(duì)多種腫瘤細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行增殖與凋亡調(diào)節(jié)，但現(xiàn)如今對(duì)心肌細(xì)胞增殖與凋亡是否也通過干預(yù)細(xì)胞周期改善心室重構(gòu)目前尚不清楚。

近年有研究表明，在心肌肥厚的發(fā)病機(jī)制中，p21參與其中并起到重要作用。在國(guó)外學(xué)者的研究中表明，左心室肥厚可使p21蛋白表達(dá)能力下降，引起心肌細(xì)胞肥大。且還有學(xué)者對(duì)阿托伐他汀的研究中發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白相關(guān)的抑制蛋白促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表，使細(xì)胞衰老過程減慢。也有研究表明，他汀類藥物主要通過對(duì)p21、p27的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的過程。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，p21表達(dá)降低可介導(dǎo)心肌細(xì)胞的肥大、促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，從而參與心肌肥厚的發(fā)生。

有研究表明PPARγ的活化可能與心肌細(xì)胞肥大的負(fù)性調(diào)節(jié)有關(guān)，可抑制心肌細(xì)胞增殖，進(jìn)而改善心室重構(gòu)。在過去的研究中人們發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀對(duì)大鼠心肌中PPARa、PPARp、PPARγ的表達(dá)有促進(jìn)作用，明顯減少了左心室壁的厚度，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)。也有學(xué)者對(duì)壓力負(fù)荷誘導(dǎo)心肌肥厚的大鼠進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可使左心室壁厚度減小，上調(diào)PPARγ蛋白的表達(dá)。因此，PPARγ的激活應(yīng)用阿托伐他汀改善心肌肥大的作用有極大關(guān)系。在該實(shí)驗(yàn)中，PPARγ表達(dá)上調(diào)可改善心肌肥厚癥狀，也證實(shí)了PPARγ表達(dá)可對(duì)心肌肥厚起到負(fù)調(diào)控作用，與既往研究基本相符圈。

在心血管方面，LiM等在體外的研究結(jié)果表明，PPARγ活化可通過誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-l，HO-1）的表達(dá)及上調(diào)p21的表達(dá)來抑制大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。Zhang D等在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也同樣表明，肺動(dòng)脈高壓大鼠PPARγ的激活可明顯降低有心室的收縮壓，抑制有心室肥厚，部分抑制肺血管的重構(gòu)，其機(jī)制可能與上調(diào)HO-1 and p21的表達(dá)有關(guān)。通過該研究可推測(cè)，阿托伐他汀可激活心肌PPARγ進(jìn)行表達(dá)，間接影響p21表達(dá)上調(diào)，在兩者共同作用下抑制了心肌肥大、心室重構(gòu)等癥狀，而具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

該研究中還發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀并不影響血脂水平，結(jié)果提示其對(duì)心臟的改善作用與血壓無關(guān)，但本文研究樣本較小，可能影響此結(jié)果。

綜上，阿托伐他汀可白行對(duì)白發(fā)性高血壓大鼠心肌細(xì)胞中PPARγ、p21上調(diào)以對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)節(jié)，對(duì)高血壓左室肥厚具有改善作用。