成體舌形貝（Lingula Bruguire）的MicroRNA表達檢測與分析

【摘要】腕足動物門（Brachiopoda）是最古老的Body plan之一，最早發(fā)現(xiàn)于早寒武世，繁盛于志留、泥盆二紀，其后延續(xù)至今[1-3]。多數(shù)腕足動物類群現(xiàn)已滅絕，舌形貝（Lingula Bruguire）是僅存的現(xiàn)生腕足動物之一。本文在Halanych等最新腕足動物分類標準的大前提下[3]，以Lingula Bruguire為研究對象，通過microRNA譜的特征分析[4]，探索原口動物與后口動物共同祖先（Protostome-deuterostome ancestor， PDA）的microRNA祖征（Plesiomorphy）狀態(tài)[5]。本研究中，我們首先提取成體Lingula Bruguire的總RNA，然后以標準方法特異性提取其中的總MicroRNA，運用東南大學自主研發(fā)的AG-100高通量測序平臺和ABI Solid 3.0測序系統(tǒng)，檢測成體Lingula Bruguire的microRNA表達狀態(tài)。在此基礎之上，運用現(xiàn)代生物信息學手段，結合MiRBase現(xiàn)有數(shù)據(jù)，逐級分析現(xiàn)生觸手冠類群（Lophophorata）、冠輪動物（Lophotrochozoa）和所有兩側(cè)對稱動物（Bilateria）的microRNA分布關系，推測出PDA基因組可能擁有l(wèi)et-7、miR-10、miR-133、miR-184和miR-92等5個microRNA，為研究microRNA在真后生動物（Eumetazoa）億萬年演化歷程中的相關變化提供研究基礎。

【關鍵詞】舌形貝；microRNA；腕足動物門；早寒武世；演化生物學

介紹

舌形貝（Lingula Bruguire）類，俗名海豆芽，最早出現(xiàn)于早寒武世[1]，屬腕足動物門（Brachiopoda）/舌形貝型亞門（Linguliformea）/舌形貝綱（Lingulata）/舌形貝目（Linguilida）/舌形貝超科（Linguloidea）/舌形貝科（Lingulidae）[6，7]。其殼由幾丁質(zhì)組成，常見于熱帶及亞熱帶的淺海近灘?，F(xiàn)生舌形貝類與相關化石屬比較，形態(tài)變化甚微，是現(xiàn)生真后生動物次亞界中最古老、形態(tài)變化最小的物種之一。

圖1為現(xiàn)生舌形貝類與相關化石屬的形態(tài)比較，圖中可看出，二者形態(tài)結構差異甚微，表明5億多年的演化歷程并沒有對舌形貝類的形態(tài)結構造成較大影響。由于觸手冠類群在形態(tài)結構和胚胎發(fā)育等方面，同時具有原口動物和后口動物兩方面特征，其分類地位至今仍存較大爭論[2， 3]。觸手冠類群的分類大致有以下四種觀點：1、由于觸手冠類群大多具有其獨特的濾食器官—輪器（Lophophoral organ）[8.10]，在物種分類上被認為是有別于冠輪動物，而獨立成支[8.9]；2、因觸手冠類群與后口動物具有一些相似的胚胎發(fā)育共性（如三體腔結構等），故歸于后口類群[13.14]；3、鑒于觸手冠類群兼有原口和后口動物的混合發(fā)育特征[8.11]，有些學者主張把觸手冠類群單獨劃分為一個獨立于原口和后口動物之外的類群[2]；4、基于不完整18s DNA序列的單基因系統(tǒng)發(fā)生（Phylogeny）分析，將觸手冠類群劃入原口動物[12]。為解決上述分類爭議，Halanych等利用完整的18s DNA序列重新解讀了相關門類的演化關系，把觸手冠類群重新鑒定為一個完整的超門類群，與擔輪動物（Trochozoa）共同構成更高一級分類的冠輪類群（Lophotrochozoa），冠輪動物與蛻皮動物（Ecdysozoa）共同組成真后生動物次亞界（Eumetazoa）的最大分支——原口動物類群（Protostomia）[9]。在此基礎之上，原口動物與后口動物（Deuterostomia）及扁蟲動物總門（Platyzoa）共同構成兩側(cè)對稱動物[15-16]。綜合分析現(xiàn)有觸手冠類群分類格局，本文以Halanych等的分類觀點為研究背景，以舌形貝類為研究對象，從microRNA角度出發(fā)[4]探索Brachiopoda與其它Body plan之間的演化關系[5]。本研究中，我們首先提取成體Lingula Bruguire的總RNA，然后以標準方法（mirVana? RNA Isolation Kit）特異性提取其中的MicroRNA，運用高通量測序平臺和現(xiàn)代生物信息先進分析手段，檢測成體Lingula Bruguire的microRNA表達狀態(tài)，結合MiRBase現(xiàn)有數(shù)據(jù)，鑒定觸手冠類群（Lophophorata）、冠輪動物（Lophotrochozoa）及原始兩側(cè)對稱動物（Bilateria）的microRNA分布類型，研究microRNA在真后生動物次亞界（Eumetazoa）演化歷程中的相關變化。

材料與方法

樣本收集

舌形貝（Lingula Bruguire）樣本取自廣西北海。以15倍體積的RNAlater（ABI，am7020）于4℃過夜保存新鮮樣本，第二天轉(zhuǎn)入-20℃長期保存（有效期為1年）。

文庫制備

采用液氮碾磨法，按標準流程提取總RNA（life technologies公司主頁，http：//www.lifetechnologies.com/）。采用mirVana? RNA Isolation Kit（AM1556）提取總RNA中的總miRNA，按照AG-100和SOLiD 3.0高通量測序平臺各自的測序流程要求，對相關的總microRNA分布進行測序文庫制備。所用相關試劑均購自Life Technologies公司和無錫艾吉因生物信息技術股份有限公司。

測序流程

使用SOLiD 3.0和AG_100兩高通量測序平臺，對相關測序文庫分別上機測序，測序流程完全遵守相關操作要求。

信息分析

首先利用SOLiD 3.0和AG_100兩測序平臺的自動分析軟件，對原始測序數(shù)據(jù)進行初步篩選聚類，過濾掉rRNA、tRNA以及其它各種類型的非編碼RNA，獲得精確測序數(shù)據(jù)。然后利用Rfam、MIREAP等經(jīng)典分析手段對測序所得數(shù)據(jù)進一步細化分析。再結合miRBase、NCBI等大型數(shù)據(jù)庫對相關測序數(shù)據(jù)進行深度分析總結。

試驗結果

經(jīng)過三輪精確數(shù)據(jù)分析，確定成體舌形貝至少表達let-7、miR-749、miR-548、miR-221、miR-79、miR-133、miR-15、miR-1729、miR-184、miR-2284、miR-146、miR-128、miR-3426、miR-194、miR-10、miR-92等microRNAs，其序列信息和表達豐度關系如表1和圖2。從表1和圖2可看出，和其它大多數(shù)動物一樣，舌形貝也表現(xiàn)為let-7高表達狀態(tài)，let-7最早發(fā)現(xiàn)于線蟲（Caenorhabditis elegans），主要行使調(diào)控細胞周期等生理功能。

根據(jù)現(xiàn)有文獻的相關介紹和成體舌形貝的組織學基礎，從演化生物學角度，挑選生理功能保守且已研究清楚的microRNA，進行生理功能概略分析，從而簡要推測成體舌形貝的相關生理學特征。miRNA-221可通過負調(diào)控細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑CDKN1B/p27和CDKN1C/p57來促進內(nèi)皮細胞的增殖。miR-133為肌肉特異性miRNAs，是一種強有力的非肌性基因的表達抑制因子，Chen等發(fā)現(xiàn)miR-133在骨骼肌細胞分化成熟過程中的有效表達，可成功抑制非肌性基因，從而提高成肌細胞的增殖速度。miR-15能從轉(zhuǎn)錄后水平對Bcl-2進行負調(diào)節(jié)，從而引起細胞的凋亡，另外，miR-15a可抑制cyclin E及其它細胞周期調(diào)節(jié)因子的合成。miR-184對上皮細胞的黏附及遷移具有調(diào)控作用，miR-184可促進細胞遷移，同時miR-184還在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，超表達miR-184可導致細胞進入凋亡程序。miR-146能夠促進轉(zhuǎn)錄抑制因子ReIB結合到TNF-α的啟動子上，來抑制細胞凋亡。miRNA-128在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中肩負重要調(diào)控作用。miR-10能夠有效抑制Hox1和Hox3的表達。miR-92在性別調(diào)控過程中參與雄性性腺的發(fā)育分化。從上述microRNA的保守生理功能出發(fā)，可看出舌形貝的細胞凋亡與細胞周期調(diào)控機制與其它動物基本一致，其肌細胞塑型基因的調(diào)控機制已基本健全，其體腔上皮細胞的遷移調(diào)控已經(jīng)基本成型。從表1中可以看出let-7、miR-749、miR-548、miR-221、miR-79、miR-133等microRNAs于成體舌形貝機體的表達量較高，但結合現(xiàn)有文獻的相關報道和舌形貝的組織學特征，很難直接判斷miR-749、miR-548、miR-79等microRNAs在成體舌形貝機體內(nèi)如何行使生理功能，這部分工作需要進一步的功能性試驗來補充。

討論

將上述數(shù)據(jù)與miRBase中冠輪類群、蛻皮類群和后口類群的microRNAs進行演化生物學比較分析。分析結果顯示，舌形貝與冠輪動物共有microRNAs包括：let-7、miR-10、miR-133、miR-184、miR-92、miR-79和miR-749（按同一門內(nèi)物種間共有頻率由大到小排序）。

從圖3可看出，let-7和miR-10為所有冠輪動物共有的microRNAs，而miR-133、miR-184、miR-92和miR-79等4個microRNAs可能是冠輪動物的祖征microRNAs。

再結合蛻皮動物的現(xiàn)有數(shù)據(jù)，放大到整個原口動物類群，可看出let-7、miR-10、miR-133、miR-184、miR-92、miR-79等6個microRNAs為原口動物共同祖先的祖征microRNAs；再進一步結合后口動物現(xiàn)有數(shù)據(jù)，放大分析范圍，可看出let-7、miR-10、miR-133、miR-184和miR-92等5個microRNA可能為原口—后口動物共同祖先所擁有的microRNA。

進一步結合現(xiàn)生原始兩側(cè)對稱動物—真渦蟲（Schmidtea mediterranea）的microRNA數(shù)據(jù)進行放大比較，可發(fā)現(xiàn)真渦蟲的microRNA特征與原口動物相似，共同擁有l(wèi)et-7、miR-10、miR-133、miR-184、miR-92、miR-79等6個microRNA?，F(xiàn)生真渦蟲并不具有口和肛門的分化，一直被認為是原始的兩側(cè)對稱動物的現(xiàn)生代表和原口—后口動物的共同祖先類型，但從本研究得到的microRNA數(shù)據(jù)出發(fā)，可推測出原口和后口動物的祖先可能在口與肛門分化之前就已分離，從而間接支持異無動物門為后口動物祖先類型[16]的結論。