山東省零售肉類樣品中分離、鑒定攜帶志賀毒素基因（stx）的O157和非O157大腸桿菌

【摘要】實(shí)驗(yàn)采用DNA探針雜交技術(shù)，對(duì)購買的53個(gè)市售肉類樣品進(jìn)行檢測，31個(gè)（58%）樣品檢測出含有stx基因的大腸桿菌，其中牛肉檢出率最高（68%）。分離的42株攜帶stx基因的大腸桿菌，均不是O157。使用O157特異免疫磁珠技術(shù)，從8個(gè)牛肉樣品中分離到攜帶eae和stx2基因的大腸桿菌O157。

【關(guān)鍵詞】產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌；O157特異免疫磁珠技術(shù)；DNA探針雜交技術(shù)

產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC）的自然宿主是牛和其他動(dòng)物，因此，零售的肉類可能被STEC污染[2]。盡管STEC包含超過200種O：H血清型，但大部分與嚴(yán)重的人類疾病沒有關(guān)系。腸出血性大腸桿菌（EHEC）屬于含編碼緊密黏附素的eae基因的STEC，可以引起嚴(yán)重的胃腸道疾病。由EHEC感染的病例部分是由志賀毒素（Stx）引起。O157：H7/-（H7或H陰性）是EHEC中主要的血清型，可是H抗原很難檢測，并且檢測之前的動(dòng)力實(shí)驗(yàn)可能導(dǎo)致H抗原丟失。因此，STEC中攜帶eae基因的O157血清型，作為典型的EHEC菌株，引起人們的極大關(guān)注。

本次實(shí)驗(yàn)研究了購買自山東省零售肉類樣品中非O157和O157的分布情況，篩選了攜帶stx基因的非O157和O157大腸桿菌，檢測了stx1、stx2和eae基因，通過RPLA方法確認(rèn)了產(chǎn)生Stx1和Stx2毒素的能力。Stx2毒素陰性的STEC O157被發(fā)現(xiàn)，鑒定這些菌株將為研究攜帶stx2基因，卻缺乏Stx2毒素的機(jī)制提供新的信息。

1、材料和方法

1.1菌株

大腸桿菌O157：H7菌株Thai-12，作為不產(chǎn)Stx2毒素的代表性的陰性對(duì)照。

1.2肉類樣品中含stx基因大腸桿菌的檢測

肉類樣品購自青島當(dāng)?shù)氐某泻褪袌觥?5g樣品加入225mL胰蛋白胨大豆肉湯（TSB），37℃培養(yǎng)6h。取1mL該增菌液接種10mL TSB，42℃培養(yǎng)2h，作為第二次增菌液。取2次增菌液分別接種DHL瓊脂和麥康凱瓊脂，37℃培養(yǎng)18～24h。

從每個(gè)平板選取40～160個(gè)疑似大腸桿菌菌落接種至尼龍膜（Hybond-N+），置于含1%NaCl的Luria-Bertani（LB）瓊脂，14℃培養(yǎng)18h。尼龍膜置于含0.5M NaOH的溶解液10min，之后用含1.0M Tris-HCl（pH 7.0）的中和液中和1min，重復(fù)3次，最后置于含1.0M Tris-HCl（pH 7.0）和1.5M NaCl的變性液10min。將膜置于80℃固定DNA 2h。每個(gè)DNA菌落印跡與含地高辛標(biāo)記的stx1和stx2基因探針進(jìn)行雜交。

標(biāo)準(zhǔn)的生化試驗(yàn)鑒定為大腸桿菌之后進(jìn)行stx1和/或stx2基因陽性分離。生化試驗(yàn)包括傳統(tǒng)的吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)和三糖鐵試驗(yàn)。符合上述特性的分離物確定為STEC。

為了定量檢測肉中的STEC，25g樣品加入225mLTSB，均質(zhì)1min，運(yùn)用MPN法檢測STEC，按照上述方法鑒別，根據(jù)MPN檢索表讀數(shù)。

1.3肉類樣品中含stx基因大腸桿菌O157的選擇性分離

取1.2中第二次增菌液1mL與包被抗O157抗體的免疫磁珠（Dynabeads）連續(xù)攪動(dòng)反應(yīng)10min，將免疫磁珠置于CHROMagar O157瓊脂培養(yǎng)，紫色的菌落按照下述PCR方法篩選stx1和stx2基因，PCR陽性的按照下述方法確定是否為O157，確定含有O157的按照上述方法確實(shí)是否為大腸桿菌。符合上述特性的分離物確定為含stx基因大腸桿菌O157。

1.4STEC的鑒定

運(yùn)用PCR方法檢測STEC中stx1、stx2和eae基因，運(yùn)用RPLA方法檢測Stx1和Stx2毒素，運(yùn)用凝集實(shí)驗(yàn)檢測O157抗原，運(yùn)用脈沖場凝膠電泳（PFGE）方法檢測DNA指紋，這些方法描述如下。

運(yùn)用PCR方法，檢測菌株于5mL LB肉湯37℃振蕩（150rpm）培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)物煮沸10min，800g離心10min，取上清液檢測。使用商業(yè)合成的引物檢測stx基因，EVT-1和EVT-2檢測stx1基因，EVS-1和EVS-2檢測stx2基因（TaKaRa Biochemicals）。PCR擴(kuò)增，按照引物生產(chǎn)商提供的程序，用1.5%的瓊脂糖凝膠檢測特異的擴(kuò)增產(chǎn)物。eae基因使用AE19和AE20引物擴(kuò)增該基因內(nèi)1，087bp的序列。擴(kuò)增程序如下：預(yù)變性96℃35min，設(shè)置35個(gè)循環(huán)，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，循環(huán)結(jié)束后最終72℃延伸7min。

運(yùn)用RPLA方法檢測Stx1和Stx2毒素，檢測菌株于酸酵母提取物培養(yǎng)基36℃振蕩（130rpm）培養(yǎng)過夜。800g離心10min。上清液中的Stx毒素使用商業(yè)化RPLA試劑盒（VTEC-RPLA）檢測。Stx毒素滴度以出現(xiàn)連續(xù)陽性反應(yīng)的最高稀釋度定義。

運(yùn)用凝集實(shí)驗(yàn)檢測O157抗原，是通過高壓過的菌體和抗O157血清凝集檢測。

為了獲得總菌體DNA的指紋，將36℃振蕩（130rpm）培養(yǎng)過夜的LB肉湯培養(yǎng)的菌株做PFGE同時(shí)用XbaI酶切。

2、結(jié)果

2.1肉類樣品中含stx基因大腸桿菌的檢測

53個(gè)牛肉、羊肉、豬肉和雞肉樣品用于含stx基因大腸桿菌的檢測，使用“STEC”作為攜帶stx1和/或stx2基因大腸桿菌的縮寫。58%的樣品分離到STEC，其中牛肉的分離率最高（68%），雞肉的最低（0%），見表1。

表1 肉類樣品中STEC的分離

肉STEC陽性樣品數(shù)/檢測樣品數(shù)（%）

牛肉21/31（68）

羊肉7/12（58）

豬肉3/8（38）

雞肉0/2（0）

總計(jì)31/53（58）

隨機(jī)選擇的3個(gè)牛肉樣品MPN法得到的STEC結(jié)果為2.3，9.3和15/g。同一個(gè)樣品分離得到的1株以上的菌株，如果基因型不同（攜帶或缺乏stx1、stx2和eae基因）和/或PFGE分型不同，則被定義為不同的菌株。31個(gè)樣品中分離到42株STEC，所有的菌株為STEC非O157，缺乏eae基因，并且stx基因型（stx1和/或stx2）不同。

2.2肉類樣品中含stx基因大腸桿菌O157菌株的分離和鑒定

使用對(duì)O157特異吸附的免疫磁珠技術(shù)，從53個(gè)肉類樣品中分離STEC O157。8個(gè)牛肉樣品中，每個(gè)分離得到1株STEC O157，其他肉類樣品沒有得到。這8株STEC O157具有相同的stx基因型（缺乏stx1，攜帶stx2）并且攜帶eae基因。

8株STEC O157和從42株STEC非O157不同stx基因型的菌株中隨機(jī)挑選16株，運(yùn)用RPLA方法檢測Stx1和Stx2毒素水平，見表2。STEC O157菌株不產(chǎn)生Stx2毒素（Stx2滴度<2），或者產(chǎn)生Stx2毒素（Stx2滴度8～32）比非O157 STEC低。

3、討論

本研究對(duì)不同肉類樣品中分離出STEC非O157的比例為58%。目前，國內(nèi)關(guān)于該方面的研究報(bào)道很少。其他國家的研究調(diào)查顯示，零售肉的STEC非O157：H7的檢出率為63%。因此，對(duì)包括非O157在內(nèi)的STEC需要開展更廣泛的研究。

應(yīng)用O157特異吸附的免疫磁珠分離技術(shù)檢測牛肉樣品中STEC O157的結(jié)果表明，STEC中STEC O157的比例很低，僅占26%。馬來西亞的一項(xiàng)研究表明，36%的零售牛肉樣品中檢測到攜帶stx2基因的STEC O157[3]。一項(xiàng)全球研究的結(jié)果顯示，牛肉中大腸桿菌O157的檢出率為0.1～54.2%[4]。還有數(shù)據(jù)顯示，亞洲國家牛肉中STEC O157的檢出相對(duì)較高。STEC O157菌株是否產(chǎn)Stx毒素，是體現(xiàn)STEC O157毒性非常重要的特征。我們通過對(duì)基因型分析得出結(jié)論，本次研究分離得到的8株STEC O157均屬于不產(chǎn)生或產(chǎn)生Stx2毒素很少的“Stx2毒素陰性”菌株。周志江教授[1]對(duì)中國零售肉類樣品中STEC O157的研究表明，吉林省牛肉和豬肉樣品中STEC O157的檢出率分別為5%和3.3%，產(chǎn)生Stx2毒素滴度較高（RPLA滴度，160～2560），并且“Stx2毒素陰性”菌株產(chǎn)Stx2毒素的能力也不盡相同，因此需要對(duì)STEC O157產(chǎn)生Stx2毒素開展更廣泛的研究。