萊菔硫烷對(duì)TNF—α誘導(dǎo)bEnd.3鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生IL—1β的影響

[摘要] 目的 研究萊菔硫烷（sulforaphane，SFN）對(duì)TNF-α誘導(dǎo)bEnd.3鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-1β的影響。 方法 體外培養(yǎng)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞系bEnd.3，TNF-α刺激前先用30 μg/mL SFN處理2 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活性，ELISA檢測(cè)IL-1β和血紅素氧合酶（heme oxygenase，HO-1）的產(chǎn)生。 結(jié)果 （0～30） μg/mL SFN對(duì)bEnd.3細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。TNF-α能顯著誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β，并能表達(dá)一定量的HO-1。經(jīng)SFN處理后，HO-1表達(dá)量增高，且IL-1β產(chǎn)生明顯降低。此外，HO-1激動(dòng)劑CoPP處理能協(xié)同SFN降低TNF-α誘導(dǎo)的IL-1β產(chǎn)生，HO-1抑制劑ZnPP能減弱SFN對(duì)IL-1β的抑制作用。 結(jié)論 SFN通過(guò)上調(diào)HO-1的產(chǎn)生從而抑制TNF-α誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞分泌IL-1β。

[關(guān)鍵詞] 萊菔硫烷；腦血管內(nèi)皮細(xì)胞；血紅素氧合酶-1；IL-1β

[中圖分類號(hào)] R741 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）10-0001-02

腦血管內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障重要組成部分，各種因素如缺氧等導(dǎo)致其功能異常后直接引起腦血管通透性增高和血管源性腦水腫，并最終導(dǎo)致腦神經(jīng)細(xì)胞損傷[1]。腦損傷程度及預(yù)后不僅取決于腦缺血缺氧的范圍和程度，而且與缺血-再灌注損傷的發(fā)生密切相關(guān)。其中氧自由基連鎖反應(yīng)是神經(jīng)元受損的核心病理環(huán)節(jié)[2，3]。生理?xiàng)l件下，機(jī)體內(nèi)自由基的生成和清除之間保持動(dòng)態(tài)平衡，但在某些病理生理?xiàng)l件下，自由基產(chǎn)生過(guò)多或清除不足時(shí)就會(huì)造成組織損傷。腦組織由于富含脂質(zhì)，本身抗氧化作用比較弱，對(duì)缺氧的耐受性低，因此最容易受到自由基的攻擊。氧自由基一方面直接使脂質(zhì)、蛋白質(zhì)過(guò)氧化，使細(xì)胞發(fā)生不可逆改變；另一方面通過(guò)刺激細(xì)胞因子、黏附分子以及各種炎性相關(guān)介質(zhì)的表達(dá)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)從而加重腦組織損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)元缺血壞死[4，3]。本研究旨在觀察萊菔硫烷對(duì)TNF-α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

鼠永生化腦血管內(nèi)皮細(xì)胞系bEnd.3購(gòu)自ATCC。培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清購(gòu)自Invitrogen；SFN（分子量177. 3，純度98.3%）購(gòu)自美國(guó)Alexis公司；鈷原卟啉 Ⅸ（CoPP），鋅原卟啉 Ⅸ（ZnPP）為Sigma-Aldrich產(chǎn)品，HO-1和IL-1β ELISA試劑盒購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

bEnd.3細(xì)胞用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、TNF-α模型組和SFN干預(yù)組。其中對(duì)照組僅加入0.1%DMSO，模型組細(xì)胞加入5 ng/mL TNF-α；SFN不同濃度干預(yù)組在模型組基礎(chǔ)上分別加入5 μg/mL、10 μg/mL、30 μg/mL SFN，于24 h后收集細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按8×104/孔接種于96孔板中（200 μL/孔），每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。SFN孵育結(jié)束前4 h各孔加入MTT溶液20 μL（5 mg/mL），隨后棄上清，并加入200 μL DMSO，充分混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度值（OD570），計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)活性，計(jì)算公式為：處理組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.4 ELISA

采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-1β和HO-1，按照深圳欣博盛生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒操作進(jìn)行。其檢測(cè)下限分別為10 pg/mL和5 pg/mL。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較采用One-way方差分析并行Student’s t檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度SFN對(duì)bEnd.3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響

為了探索SFN唑最佳的作用濃度，本研究采用（0～30） μg/mL對(duì)bEnd.3細(xì)胞的活性進(jìn)行了觀察，結(jié)果顯示，（0～30） μg/mL SFN唑?qū)End.3細(xì)胞增殖活性無(wú)明顯影響（圖1），因此隨后的實(shí)驗(yàn)將用濃度高達(dá)30 μg/mL的SFN進(jìn)行。

2.2 SFN對(duì)TNF-α誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β的影響

TNF-α刺激前，bEnd.3細(xì)胞無(wú)IL-1β產(chǎn)生。5 ng/mL TNF-α處理后，IL-1β含量明顯升高。而10～30 μg/mL SFN能明顯降低TNF-α誘導(dǎo)的IL-1β產(chǎn)生，見(jiàn)圖2。

2.3 SFN對(duì)HO-1表達(dá)的影響

ELISA結(jié)果顯示，bEnd.3細(xì)胞未刺激條件下HO-1表達(dá)水平較低。TNF-α處理后HO-1表達(dá)有所增加；而SFN處理后，與TNF-α相比HO-1表達(dá)進(jìn)一步增高（圖3）。

2.4 HO-1抑制劑與激動(dòng)劑對(duì)TNF-α誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β的影響

HO-1抑制劑ZnPP預(yù)處理后，能減弱SFN對(duì)IL-1β的抑制作用。而HO-1激動(dòng)劑CoPP則能進(jìn)一步協(xié)同SFN降低TNF-α誘導(dǎo)的IL-1β產(chǎn)生（圖4）。

3 討論

HO-1是催化血紅素裂解為膽綠素、一氧化碳以及游離鐵的限速酶，其主要有三種同工酶，其中HO-1屬誘導(dǎo)型，可被氧應(yīng)激、重金屬離子等多種因素誘導(dǎo)，并已被證明有細(xì)胞保護(hù)作用[5]。有研究顯示，上調(diào)HO-1表達(dá)可有效降低氧化應(yīng)激導(dǎo)致的肺上皮細(xì)胞損傷，相應(yīng)的，HO-1基因缺陷型小鼠對(duì)炎癥性肺損傷的敏感性大大增高。此外，轉(zhuǎn)染并表達(dá)HO-1的小鼠，心肌缺血-再灌注損傷時(shí)可有效減少心肌梗死面積。以上研究表明HO-1是心血管疾病的內(nèi)源性防護(hù)系統(tǒng)[6]。

基于以上依據(jù)，抑制氧化應(yīng)激可能是治療各種缺血-再灌注導(dǎo)致的腦損傷的重要策略。目前臨床上已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種抗氧化劑，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有一定的療效，但臨床使用過(guò)程中又存在諸多缺陷[7，8]。主要包括無(wú)法通過(guò)血腦屏障、穩(wěn)定性差、副作用大等缺點(diǎn)。SFN是一種異硫氰酸鹽類物質(zhì)，主要來(lái)源于十字花科蔬菜。研究表明，SFN是一種Ⅱ相抗氧化和解毒酶的誘導(dǎo)劑，具有抗氧化損傷等多重效應(yīng)。有研究顯示，在很多神經(jīng)系統(tǒng)急、慢性疾病的動(dòng)物模型中，SFN被證實(shí)有很好的神經(jīng)保護(hù)作用[9]。但SFN對(duì)腦缺血的治療作用的研究還甚少[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷發(fā)生的過(guò)程中，誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子、內(nèi)皮素等雖然能代償性引起HO-1表達(dá)的增加，但這種代償往往難以平衡體內(nèi)氧化還原狀態(tài)。而在SFN誘導(dǎo)下HO-1表達(dá)顯著增加。SFN處理后能顯著上調(diào)HO-1的表達(dá)。TNF-α作為一種促炎因子，它和IL-1β表達(dá)的增加可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)分子間黏附分子和內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，使大量白細(xì)胞在腦實(shí)質(zhì)中聚集、浸潤(rùn)，并釋放多種炎癥介質(zhì)加重炎癥反應(yīng)。SFN處理后IL-1β明顯減少。這表明SFN對(duì)TNF-α誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的抑制作用是通過(guò)上調(diào)HO-1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

腦血管病不僅是常見(jiàn)的臨床急癥，而且是嚴(yán)重的社會(huì)—醫(yī)學(xué)—經(jīng)濟(jì)問(wèn)題，有效的治療方法也相當(dāng)缺乏，因此本研究不但對(duì)探索SFN的藥理機(jī)制具有一定的參考價(jià)值，也能為尋找新的治療方法和有效的干預(yù)策略提供了一定的參考。

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（收稿日期：2013-02-05）