建立鱟試劑法檢測(cè)雙黃連粉針劑中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法

【摘 要】建立鱟試劑法檢測(cè)雙黃連粉針劑細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，以適應(yīng)雙黃連粉針劑生產(chǎn)過程中快速檢驗(yàn)的需要。方法：中國(guó)藥典2010版二部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。結(jié)果：雙黃連粉針劑對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)無干擾作用。結(jié)論：本法簡(jiǎn)便、快速，可用于雙黃連粉針劑中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)。

【關(guān)鍵詞】雙黃連粉針劑；鱟試劑法；細(xì)菌內(nèi)毒素；干擾試驗(yàn)

雙黃連粉針劑具有清熱解毒，消炎等功效，臨床上廣泛用于上呼吸道感染、急性支氣管炎、肺炎的治療。目前本品中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法為熱源檢查，但是熱原法（即家兔法）生物差異性大，靈敏度低，所需經(jīng)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)。鱟試劑法是國(guó)際上至今為止檢測(cè)內(nèi)毒素最好的方法，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)將鱟試劑法代替熱原法。

1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1電子天平（BS224S）；對(duì)開門凈化干熱滅菌柜（DMH—0.64m3）；恒溫培養(yǎng)箱（HH.B11.360）；溫度計(jì)（HD2101.1）；旋渦混合器（XW-80A）。

1.2細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE福州新北生化工業(yè)有限公司100910）；檢查用水（BET，廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司090803）；鱟試劑1（TAL1福州新北生化工業(yè)有限公司0.25EU/ml（100802）、0.125EU/ml（100605）、0.06EU/ml（100711））；鱟試劑2（TAL2湛江安度斯生物有限公司0.25EU/ml（100613）、0.125EU/ml（101201）、0.06EU/ml（100801））。

1.3所需玻璃器皿按規(guī)定除熱原。

1.4供試品。雙黃連粉針劑（哈藥集團(tuán)中藥二廠，400mg/支，批號(hào)為0910211、1001214、1101210，樣品均按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行熱原檢查，結(jié)果均符合規(guī)定）；雙黃連粉針劑藥液（哈藥集團(tuán)中藥二廠，批號(hào)為110807、110808、110809，樣品均按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行熱原檢查，結(jié)果均不符合規(guī)定）

2.實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1鱟試劑靈敏度（λ）復(fù)核

依據(jù)中國(guó)藥典2010版二部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢查，均符合規(guī)定。

2.2供試品內(nèi)毒素限值（即L值）的確定[1]

供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素閾值（K）為5.0EU/（kg·h），人用每公斤體重每小時(shí)最大注射量（M）為1ml/（kg·h），則L=K/M=5.0/1=5.0EU/ml。以此為依據(jù)來確定供試品最大有效稀釋倍數(shù)。

2.3供試品的最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定

MVD=L/λ0.03=5.0/0.03=167倍（λ0.03即0.03EU/ml，為現(xiàn)今我國(guó)市售鱟試劑最高靈敏度）。

2.4干擾實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)[2]

預(yù)實(shí)驗(yàn)是對(duì)供試品的一系列稀釋液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證在多大稀釋倍數(shù)下供試品對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)無干擾，所以首先要確定供試品系列稀釋倍數(shù)。目前市售鱟試劑靈敏度通常為0.5～0.03EU/ml，于是用BET將供試品稀釋至如下倍數(shù)：10倍（D0.5）、20倍（D0.25）、40倍（D0.125）、80倍（D0.06）、160倍（D0.03）。其中最大稀釋倍數(shù)不得超過MVD（即167倍），作為A系列；同時(shí)每一稀釋濃度下均制備含有2濃度CSE的雙黃連粉針劑溶液為B系列。用兩個(gè)廠家的TAL（0.25EU/ml），分別與A和B系列反應(yīng)并設(shè)陽(yáng)性對(duì)照管及陰性對(duì)照管，結(jié)果見表1。

根據(jù)干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果可初步判斷：雙黃連粉針劑的最小不干擾稀釋倍數(shù)為80倍，且用不同廠家的鱟試劑對(duì)三批樣品檢測(cè)結(jié)果一致。

2.5干擾實(shí)驗(yàn)

干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，雙黃連粉針劑稀釋80倍后對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)都不存在干擾作用，于是選擇最小不干擾稀釋倍數(shù)——80倍作為供試品的稀釋倍數(shù)進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。先用BET將三批供試品稀釋成1：80稀釋液做為供試品溶液，即A系列。用BET和三批供試品的稀釋液將CSE制成0.5，0.25，0.125，0.0625EU/ml的溶液做為干擾實(shí)驗(yàn)系列，即B系列。再用BET將CSE制成0.5，0.25，0.125，0.0625EU/ml的溶液做為TAL標(biāo)示靈敏度的對(duì)照系列，即C系列。再用BET做陰性對(duì)照液，即D系列。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果表明ES和Et均在0.5λ（ES）～2λ（ES）范圍內(nèi)，說明供試品進(jìn)行80倍稀釋后可以排除干擾作用，在低于或等于此濃度下即可使用鱟試劑法。

2.6細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取三批供試品進(jìn)行80倍稀釋，TAL選用2批0.125EU/ml進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)溶液的制備同預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均符合中國(guó)藥典對(duì)其有效性的規(guī)定。

2.7對(duì)比實(shí)驗(yàn)

又選取了三批經(jīng)家兔法檢驗(yàn)內(nèi)毒素超標(biāo)的供試品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證超標(biāo)供試品是否對(duì)實(shí)驗(yàn)有干擾，實(shí)驗(yàn)方法同2.6。三批供試品的檢驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，兩種檢驗(yàn)方法一致，說明內(nèi)毒素超標(biāo)的供試品對(duì)本實(shí)驗(yàn)無干擾作用。

3、討論

通過本實(shí)驗(yàn)確定了雙黃連粉針劑進(jìn)行80倍稀釋后可以排除對(duì)TAL的干擾作用，雙黃連粉針劑在等于或低于此濃度下即可使用鱟試劑法。

不同廠家的鱟試劑對(duì)供試品的抗干擾能力不盡相同，本實(shí)驗(yàn)選用兩個(gè)廠家的鱟試劑，均無干擾。

又選取了三批內(nèi)毒素超標(biāo)的供試品進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果超標(biāo)供試品對(duì)實(shí)驗(yàn)無干擾。

本法比家兔法簡(jiǎn)便、快速，可用于雙黃連粉針劑中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)。