甲狀旁腺素對(duì)去勢(shì)雌性小鼠骨折愈合的影響

李偉龍，孟越，余霄，龐清江

甲狀旁腺素（PTH）是公認(rèn)的促骨形成藥物[1]。既往研究表明，PTH可以顯著增加小鼠股骨、脛骨和全身的骨密度，脛骨骨礦物含量也明顯增加[2]。在一項(xiàng)大樣本的臨床研究中，PTH可以顯著增加絕經(jīng)后女性椎體、股骨頸的骨密度，明顯降低骨折風(fēng)險(xiǎn)，背痛癥狀也顯著減輕[3]。能否將其促進(jìn)骨形成的作用運(yùn)用到骨折愈合期來(lái)加速患者的康復(fù)是目前的研究熱點(diǎn)，但是PTH連續(xù)大劑量促進(jìn)骨吸收和間斷小劑量促進(jìn)骨形成的雙向骨調(diào)節(jié)機(jī)制導(dǎo)致PTH并沒(méi)有達(dá)到理想中的效果[4]。本研究將觀(guān)察不同甲狀旁腺素模擬肽對(duì)于去勢(shì)雌性小鼠骨折愈合的影響，為開(kāi)發(fā)基于PTH更有效、副作用更少的促骨形成藥物提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.2動(dòng)物模型的建立 按照經(jīng)典的切除雙側(cè)卵巢的方法建立骨質(zhì)疏松模型[5]。術(shù)后連續(xù)3d腹腔注射青霉素（80000U/kg）。將去勢(shì)的小鼠常規(guī)飼養(yǎng)4周后，異氟烷（300 ml/min）吸入麻醉后，左側(cè)大腿備皮、皮膚消毒，參考小鼠股骨骨折模型相關(guān)的文獻(xiàn)[6]，于左大腿后外側(cè)作1.5 cm的切口，鈍性分離肌肉及軟組織，暴露股骨，從膝關(guān)節(jié)處逆行插入直徑為0.45mm鋼針進(jìn)行髓內(nèi)固定，直視下用手術(shù)刀（15#）切斷股骨中下1/3段部分，造成橫行骨折。術(shù)畢縫合切口。術(shù)后連續(xù)3天腹腔注射青霉素（80 000 U/kg），術(shù)后定時(shí)觀(guān)察傷口愈合情況。

1.3藥物治療 動(dòng)物模型建立后，將所有小鼠隨機(jī)分成3組，每組16只，使用相應(yīng)的藥物進(jìn)行皮下注射。PTH（1-28）組（400 g/kg），PTH（1-34）組（40 g/kg）及對(duì)照組（等劑量0.9%氯化鈉注射液），每周5 d，連續(xù)4周。本實(shí)驗(yàn)的PTH的劑量以文獻(xiàn)[7]為參考。在骨折術(shù)后的2周和4周分別處死各組小鼠8只，收集左側(cè)股骨進(jìn)行檢測(cè)。

1.4骨痂處Micro-CT檢查 將左側(cè)股骨分離，剝離周?chē)能浗M織及肌肉，并拔除鋼針，將整段股骨浸泡在10%的甲醛48 h，后取出放在 70%的酒精保存在4℃，取左側(cè)股骨進(jìn)行 Micro-CT掃描（skyscan1176，Bruker，USA），股骨用濕潤(rùn)的紙巾包裹，放入樣本掃描固定器中，確保股骨長(zhǎng)軸和掃描器長(zhǎng)軸一致，掃描參數(shù)設(shè)定：選定全部骨痂區(qū)域，50kV，98 A，每層厚度9 m，掃描結(jié)束后運(yùn)用Micro-CT自帶軟件進(jìn)行新生骨痂區(qū)域的選定，并對(duì)以下參數(shù)進(jìn)行量化統(tǒng)計(jì)：骨密度（BMD）、骨體積（BV）、相對(duì)骨體積（BV/TV）、平均骨小梁厚度（Tb.Th）。

1.5生物力學(xué)檢測(cè) 進(jìn)行骨 Micro-CT掃描后的股骨，進(jìn)行三點(diǎn)彎曲測(cè)試。選取支點(diǎn)跨距為6mm，在骨痂中點(diǎn)處垂直施加載荷，速率為2mm/min。發(fā)生骨折時(shí)記錄下最大力，根據(jù)力與位移曲線(xiàn)計(jì)算出剛度。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程均由試驗(yàn)機(jī)（Instron E1000，Instron，Norwood，MA，USA）自帶軟件進(jìn)行記錄、分析。

1.6統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析或LSD-檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1BMD值 術(shù)后2周和4周，PTH（1-34）組的BMD值均高于PTH（1-28）組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=3.56、12.48，均＜0.05）；術(shù)后 4 周，PTH（1-28）組的BMD高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=2.32＜0.05）。見(jiàn)表 1。

2.2Micro-CT數(shù)據(jù) 術(shù)后2周和4周，PTH（1-28）組和 PTH（1-34）組的 BV 值均高于對(duì)照組（均＜0.05）；從術(shù)后2周、4周，每組的BV值均逐漸在下降，且PTH（1-28）組和 PTH（1-34）組的 BV 值在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＜0.05）。見(jiàn)表2。

目前淮山的加工產(chǎn)品主要有鮮切淮山、速凍淮山、淮山干制、淮山果蔬復(fù)合飲料、淮山保健酸奶、淮山焙烤食品、速溶淮山粉等。

術(shù)后2周和4周，PTH（1-34）組的BV/TV值均高于對(duì)照組（=3.51、4.10，均＜0.05）；術(shù)后2周，對(duì)照組與 PTH（1-28）組的BV/TV差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=1.33＞0.05）；術(shù)后 4 周，PTH（1-34）組與PTH（1-28）組的BV/TV差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（=2.53＜0.05）。見(jiàn)表3。

術(shù)后2周和4周，PTH（1-28）組和PTH（1-34）組的Tb.Th值均高于對(duì)照組（均＜0.05）；PTH（1-34）組與PTH（1-28）組的術(shù)后2周Tb.Th差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=2.01，＞0.05）；兩組術(shù)后4周Tb.Th差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=3.08，＜0.05）。見(jiàn)表4。

2.3生物力學(xué)數(shù)據(jù) 術(shù)后2周和4周，PTH（1-28）組和 PTH（1-34）組的剛度和最大力均明顯高于對(duì)照組（≥17.017，均＜ 0.05）；術(shù)后 2 周，PTH（1-34）組的剛度(10.1±0.8)N/m 和最大力（5.0±0.7）N 均明顯高于PTH（1-28）組的剛度（8.6±0.7）N/m 和最大力（4.3±0.5）N（ =2.60、3.82，均＜ 0.05）；術(shù)后 4 周，PTH（1-34）組的剛度（17.0±2.8）N/m和最大力（8.9±1.1）N均明顯高于 PTH（1-28）組的剛度（14.2±2.7）N/m和最大力（7.0±1.0）N（=2.41、4.26，均＜0.05)。

3　討論

雌性小鼠切除雙側(cè)卵巢制作骨質(zhì)疏松模型已廣泛應(yīng)用于骨折愈合領(lǐng)域的研究[5]，本文參考相關(guān)的小鼠骨折模型的建立方法[6]，對(duì)去勢(shì)小鼠行股骨中下1/3段橫行截骨，成功制作骨質(zhì)疏松性骨折的小鼠模型。

PTH對(duì)維持人體內(nèi)鈣磷調(diào)節(jié)的平衡起到重要作用，2002年美國(guó)FDA批準(zhǔn)低劑量PTH間斷性皮下注射治療骨質(zhì)疏松[7]，2010年P(guān)TH被批準(zhǔn)進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)，治療女性絕經(jīng)后重度骨質(zhì)疏松。有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，年紀(jì)大于50歲的白種人群中，有50%的女性和20%的男性在今后的一生中會(huì)發(fā)生脆性骨折[8]。因此，如何將其有效地應(yīng)用到骨質(zhì)疏松性骨折的患者中是目前臨床和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。但是由于PTH的雙向調(diào)節(jié)作用使PTH的促骨形成作用并沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的療效[4]。這主要是由于 PTH可以通過(guò)激活PTHR1受體（G蛋白結(jié)合受體），從而激活多個(gè)信號(hào)通路，目前與成骨相關(guān)的幾個(gè)信號(hào)通路包括cAMP/PKA、PLC/PKC和非PLC/PKC信號(hào)通路[9]。既往研究顯示，cAMP/PKA信號(hào)通路是PTH促進(jìn)骨形成的主要機(jī)制，PLC/PKC沒(méi)有促進(jìn)骨形成的作用，主要是輔助cAMP/PKA的破骨作用[10-11]；前期研究發(fā)現(xiàn)，非PLC/PKC信號(hào)通路可以促進(jìn)受力區(qū)松質(zhì)骨的形成，進(jìn)而促進(jìn)新骨形成[12]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，PTH（1-34）具有天然的甲狀旁腺素的所有活性，可以激活上述三條通路；PTH（1-28）則去除了PTH(29-34)肽段，導(dǎo)致PTH（1-28）只能激活cAMP/PKA和PLC/PKC信號(hào)通路[13-14]。

Micro-CT數(shù)據(jù)顯示，術(shù)后2周和4周，PTH（1-34）組的BMD值明顯均高于PTH（1-28）組，而 PTH（1-28）相比于對(duì)照組，也能明顯提高骨痂的BMD值（均＜ 0.05）；術(shù)后 2 周和 4 周，PTH（1-34）相較于其他組均具有較高的BV/TV值；術(shù)后 2周，PTH（1-28）組和PTH（1-34）組具有較高的BV；術(shù)后2周和4周，PTH（1-28）組和PTH（1-34）組均具有較高Tb.Th，且PTH（1-34）組均優(yōu)于PTH（1-28）組（均＜0.05）。表明PTH可以提高骨折部位的骨組織平均密度并增加骨量，同時(shí)能夠促進(jìn)骨小梁的微結(jié)構(gòu)的改變，說(shuō)明PTH可以通過(guò)激活PTHR1受體促進(jìn)小鼠骨折部位骨痂的形成和重塑[15]。同時(shí)，PTH（1-28）組在促進(jìn)骨折愈合方面也具有較好的功效，可能是由于PTH（1-28）激活了能產(chǎn)生主要促骨形成作用的 cAMP/PKA信號(hào)通路，PTH（1-34）組在促進(jìn)骨量增加方面優(yōu)于PTH（1-28）組（＜0.05），鑒于該兩種甲狀旁腺素模擬肽激活的通路的差異，推測(cè)兩種模擬肽在骨折愈合的差別可能是由于PTH（1-34）在激活cAMP/PKA和PLC/PKC信號(hào)通路的基礎(chǔ)上，還能額外激活非PLC/PKC信號(hào)通路以增加骨痂的骨量和骨密度。

骨折愈合是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，受到自身和外界等多方面因素的影響，骨折愈合的臨床標(biāo)準(zhǔn)除了骨痂的連續(xù)和骨折線(xiàn)的模糊，還需要骨折部位恢復(fù)到一定的強(qiáng)度。本組術(shù)后2周和4周，PTH（1-34）組和PTH（1-28）組的剛度和最大力均明顯高于對(duì)照組，且PTH（1-34）組優(yōu)于 PTH（1-28）組（均＜ 0.05）?？梢?jiàn)PTH（1-34）和 PTH（1-28）均可恢復(fù)骨折力學(xué)穩(wěn)定和強(qiáng)度，而PTH（1-28）在恢復(fù)力學(xué)穩(wěn)定上稍差于PTH（1-34）。結(jié)合之前的Micro-CT結(jié)果，推斷PTH在促進(jìn)骨折愈合過(guò)程中之所以具有較好的生物力學(xué)性能，在早期，可能是通過(guò)增加骨量來(lái)增強(qiáng)骨痂的力學(xué)性能，到了后期則主要通過(guò)對(duì)骨痂的改建和重塑來(lái)恢復(fù)骨折處骨痂的力學(xué)；而鑒于PTH（1-34）組的生物力學(xué)性能亦明顯優(yōu)于 PTH（1-28）組，故推斷可能是PTH（1-34）通過(guò)非PLC/PKC信號(hào)通路能夠在骨質(zhì)疏松性骨折的愈合過(guò)程中對(duì)骨微結(jié)構(gòu)進(jìn)行改建和重塑以恢復(fù)骨折的力學(xué)穩(wěn)定及強(qiáng)度。

表1　術(shù)后2周和4周3組BMD值

表2　術(shù)后2周和4周3組BV值 mm3

表3　術(shù)后2周和4周3組BV/TV值 %

表4　術(shù)后2周和4周3組Tb.Th值 m

本實(shí)驗(yàn)也有以下不足之處：一是樣本量較少，二是本研究的觀(guān)察時(shí)間只有4周。PTH對(duì)于骨質(zhì)疏松性骨折愈合的后期療效如何還有待更長(zhǎng)時(shí)間的研究觀(guān)察。

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