玉米谷胱甘肽過氧化物酶的生物信息學分析

摘要：對植物基因組數(shù)據(jù)庫和過氧化物酶數(shù)據(jù)庫中玉米谷胱甘肽過氧化物酶（Zea mays Glutathione peroxidase，ZmGPXs）進行查找和比對，確定了6個ZmGPXs，采用生物信息學方法對其進行了理化性質、亞細胞定位、結構域、高級結構、外顯子和內(nèi)含子構成等分析。結果表明，盡管6個ZmGPXs序列的氨基酸數(shù)量不同，但均屬于堿性蛋白質，具有6個外顯子和5個內(nèi)含子，其中5個ZmGPXs高級結構表現(xiàn)為二聚體，具有植物GPXs的特征基序。亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)ZmGPXs主要定位于線粒體、葉綠體、過氧化物酶體和細胞質中。結構域分析表明ZmGPXs屬于硫氧還蛋白超家族。

關鍵詞：谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）；玉米（Zea mays）；生物信息學

中圖分類號：Q554+6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）11-2675-05

1 方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

數(shù)據(jù)資料來源于植物基因組數(shù)據(jù)庫（Phytozome，http：//www.phytozome.net）和過氧化物酶數(shù)據(jù)庫（PeroxiBase，http：//peroxibase.toulouse.inra.fr/），從中獲得ZmGPXs的基因序列和氨基酸序列。

1.2 方法

利用DNAMAN軟件對所獲得的氨基酸序列進行序列比對和理化性質分析，其保守結構域、磷酸化修飾、跨膜結構域、亞細胞定位和高級結構分別采用NCBI protein blast（http：//blast. ncbi. nlm. nih.gov/）、NetPhos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、TMHMM2.0 Server（http：//www. cbs. dtu. dk / services / TMHMM-2.0）、PSORT（http：// psort. hgc. jp / form. html）和SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）在線工具分析，利用MEGA 5.0進行系統(tǒng)進化樹分析。

2 結果與分析

2.1 ZmGPXs檢索分析結果

經(jīng)過檢索，在植物基因組數(shù)據(jù)庫（Phytozome）中共獲得7個編碼玉米GPXs的基因序列（ZmGPXs），注冊號分別為ZM2G011025、ZM2G013299、ZM2G12479、 ZM2G135893、 ZM2G144153、ZM2G329144和ZM5G884600。在過氧化物酶數(shù)據(jù)庫（PeroxiBase）中也獲得了7個ZmGPXs序列，其名稱分別為ZmGPX01、ZmGPX02、ZmGPX03、ZmGPX04、ZmGPX01-2、ZmGPX01-3和ZmGPX03-2。采用DNAMAN軟件和NCBI protein blast對來源于2個數(shù)據(jù)庫中的玉米GPXs序列進行比對分析，結果表明，在基因組數(shù)據(jù)庫所獲得的ZmGPXs序列中的ZM2G144153、 ZM2G329144、 ZM2G135893、ZM2G12479和ZM2G013299等5個序列編碼的氨基酸序列分別與PeroxiBase中的ZmGPX01、ZmGPX02、ZmGPX03、ZmGPX04和ZmGPX03-2同源性達到100%，ZM2G013299與ZmGPX01-3同源性為98%，ZM5G884600與ZmGPX01-2同源性為95%。ZM2G011025沒有獲得較高的同源性分析結果。根據(jù)上述比對分析結果，玉米基因組中推測的7個編碼ZmGPXs的序列中有6個可以確定，參考PeroxiBase的命名，分別為ZmGPX01、ZmGPX02、ZmGPX03、ZmGPX04、ZmGPX03-2和ZmGPX01-2，另外1個（ZM2G011025）尚不能確定。

2.2 ZmGPXs的理化性質

對經(jīng)過比對分析確定的6個ZmGPXs氨基酸序列進行理化性質分析，結果見表1。由表1可知，6個ZmGPXs中氨基酸數(shù)量最少為166，最多為246；分子量最小是18.347 ku，最大為26.811 ku。ZmGPXs的等電點（pI）介于7.04～10.06之間，其中ZmGPX04的等電點為10.06。用TMHMM 2.0 Server在線軟件分別對6個ZmGPXs的氨基酸序列進行分析，所有肽鏈跨膜結構域的可能性均為0，說明ZmGPXs序列不存在跨膜結構，不是跨膜蛋白。

2.3 ZmGPXs磷酸化修飾位點與亞細胞定位預測

用NetPhos 2.0 Server分別對6個ZmGPXs的氨基酸序列進行潛在磷酸化位點分析，比較6個ZmGPXs所具有的潛在磷酸化位點總數(shù)，可見ZmGPX03的磷酸化位點數(shù)最高，為18，其次為ZmGPX01和ZmGPX01-2，分別為15和14，而ZmGPX02具有的磷酸化位點數(shù)最少，為7。

GPXs功能的發(fā)揮與其亞細胞定位有關，使用PSORT在線工具對6個ZmGPXs進行亞細胞定位預測分析。結果顯示，6個ZmGPXs主要定位于細胞質、線粒體、葉綠體和過氧化物酶體中，除ZmGPX03-2外，其他5個ZmGPXs皆分布于線粒體中；ZmGPX01、ZmGPX02、ZmGPX03和ZmGPX03-2分布于過氧化物酶體中；而ZmGPX01、ZmGPX04、ZmGPX03-2和ZmGPX01-2分布于葉綠體中；此外ZmGPX02還被定位于質膜上。

2.4 ZmGPXs結構域特征

采用NCBI protein blast對6個ZmGPXs進行保守結構域（Conserved domains）在線分析，結果見圖1。從圖1可以看出，盡管6個序列的氨基酸數(shù)量不同，但具有相同的特征：都屬于硫氧還蛋白超家族（Thioredoxin-like superfamily）以及谷胱甘肽過氧化物酶，都具有3個催化殘基位點和二聚體界面。

利用DNAMAN對6個ZmGPXs進行多序列比對分析（圖2）。結果顯示，6個序列都具有3個保守性較高的結構域：KVLLINVAS、FEILAFPCNQF和KWNFSKFLVD，皆為GPXs的特征基序；具有3個保守的催化殘基，即C、Q和W。因此6個序列都屬于GPXs家族成員。此外，6個序列都具有3個半胱氨酸殘基（C），該位點在動物的PHGPXs中為硒代半胱氨酸殘基。

2.5 ZmGPXs的外顯子和內(nèi)含子構成

利用植物基因組數(shù)據(jù)庫對編碼ZmGPXs的基因序列ORF（Open reading frame）的外顯子和內(nèi)含子的構成進行分析。結果顯示ZmGPXs的ORF區(qū)均由6個外顯子和5個內(nèi)含子構成，內(nèi)含子的剪切位點符合真核生物GT-AG規(guī)則，外顯子的長度具有高度保守性，內(nèi)含子的長度差異較大。每個基因的第2個至第5個外顯子的長度分別是77 bp、62 bp左右、119 bp、168 bp左右。第1個外顯子長度差異較大，ZmGPX03和ZmGPX04第1個外顯子的長度大于200 bp，其他序列的第1個外顯子的長度介于39～54 bp之間。除ZmGPX01的第6個外顯子長度為89 bp外，其他5個ZmGPXs的第6個外顯子的長度介于30～36 bp之間。將ZmGPXs序列的3個保守結構域（即GPXs特征基序）與基因序列比對分析，顯示3個保守結構域（KVLLINVAS、FEILAFPCNQF和KWNFSKFLVD）分別對應在第2和3個、第4個、第5個外顯子上，并且位置相對保守（圖3）。

2.6 系統(tǒng)進化樹分析

利用MEGA 5.0構建ZmGPXs家族的氨基酸序列系統(tǒng)進化樹（圖4）以及ZmGPXs家族與AtGPXs家族的氨基酸序列系統(tǒng)進化樹（圖5）。圖4顯示6個ZmGPXs可聚分為兩類，一類包括4個（ZmGPX01、ZmGPX01-2、ZmGPX02和ZmGPX03-2），另一類包括2個（ZmGPX03和ZmGPX04）。

比較6個ZmGPXs和8個AtGPXs在進化上的關系，除了AtGPX4與ZmGPX02、AtGPX6與ZmGPX04同源性較高外，總體上ZmGPXs與AtGPXs的同源性較低。

2.7 高級結構預測

同一段氨基酸序列因為具有不同的高級折疊結構而具有不同的生物功能，因此預測基因的蛋白質高級結構對于研究基因的功能有重要的意義。利用SWISS-MODEL對ZmGPXs的高級結構進行預測，如圖6所示。結合圖6以及表2中的統(tǒng)計結果可以看出，除ZmGPX02為單體形式（5個α-螺旋、6個β-折疊片與一些轉角和無規(guī)則卷曲相互連接而形成）外，其他5個ZmGPXs的三維結構均為二聚體結構，基本由12個α-螺旋、8～12個β-折疊片與一些轉角和無規(guī)則卷曲相互連接而形成，此外，ZmGPX02的折疊結構與其他ZmGPXs的二聚體中單體的折疊結構也存在明顯差異。說明兩種結構類型的ZmGPXs發(fā)揮功能的方式可能不同。

3 小結與討論

根據(jù)兩個數(shù)據(jù)庫的比對分析，獲得了編碼ZmGPXs的6個基因序列，分別位于2號和5號染色體上，其蛋白質分子量為18.347～26.811 ku，均不存在跨膜結構域。ZmGPX03、ZmGPX01和ZmGPX01-2的磷酸化位點較多。一般來說，多肽鏈中的氨基酸潛在的磷酸化位點越多，發(fā)揮更多功能的可能性就越大。

對ZmGPXs進行亞細胞定位預測的結果表明，6個ZmGPXs主要定位于線粒體、葉綠體、過氧化物酶體和細胞質中，其中ZmGPX04和ZmGPX01-2均在線粒體和葉綠體中分布，ZmGPX01、ZmGPX03和ZmGPX03-2在線粒體、葉綠體和過氧化物酶體上均有分布。蛋白質的亞細胞定位與其功能相關，上述亞細胞定位預測分析結果提示GPXs發(fā)揮作用的位點與產(chǎn)生活性氧的部位有關。

對ZmGPXs結構域的分析結果顯示，6個ZmGPXs均具有3個催化殘基和二聚體界面。ZmGPX03和ZmGPX04與其他4個ZmGPXs相比多約70個氨基酸，但是催化殘基和二聚體界面距離C端較近，說明GPXs功能發(fā)揮的位點靠近C端，而N端序列可能主要與蛋白質的亞細胞定位有關。

GPXs的3個標志性基序（KVLLINVAS、FEILAFPCNQF和KWNFSKFLVD）在6個ZmGPXs中高度保守，且這些特征基序在擬南芥AtGPXs中也具有較高的保守性，說明在植物進化過程中，GPXs的特征基序在其執(zhí)行功能時發(fā)揮著重要的作用，保守性很強。

ZmGPXs基因序列具有6個外顯子和5個內(nèi)含子，其中保守結構域所對應的外顯子（第2～5個）長度保守性較強，第1個和第6個外顯子長度變化較大，內(nèi)含子的長度差異明顯，這種特點也體現(xiàn)在8個AtGPXs中。編碼GPXs的基因序列在不同物種的基因組中高度保守，原因可能是保守的外顯子序列是植物GPXs行使功能必需的序列。差異外顯子序列主要表現(xiàn)在第1個和第6個外顯子，可能與行使其特有功能有關。內(nèi)含子的差異可能是不同基因存在的不同調(diào)控機制，同時也體現(xiàn)了進化變異的特點。

雖然結構域分析顯示6個ZmGPXs都具有二聚體界面，但是ZmGPXs編碼的蛋白質高級結構預測結果顯示6個ZmGPXs在作用形式上分為兩類，一類以單體形式存在（ZmGPX02），一類以二聚體形式存在，說明ZmGPXs可能以二聚體形式發(fā)揮功能，也可能以單體的形式發(fā)揮作用。

從進化關系上看，ZmGPXs與AtGPXs的同源性較低。但是ZmGPXs與AtGPXs在結構域上的高度保守性提示植物GPXs進化過程中保留了其基本的催化功能，而ZmGPXs與AtGPXs在序列與結構上的差異顯示在不同植物物種中GPXs具有一定的差異。

參考文獻：

[1] 杜秀敏，殷文璇，趙彥修，等.植物中活性氧的產(chǎn)生及清除機制[J].生物工程學報，2001，17（2）：121-125.

[2] GUETA-DAHAN Y， YANIV Z， ZILINSKAS B A， et al. Salt and oxidative stress： Similar and specific responses and their relation to salt tolerance in Citrus[J]. Planta，1997，203（4）：460-469.

[3] HERBETTE S， LENNE C， LEBLANC N， et al. Two GPX-like proteins from Lycopersicon esculentum and Helianthus annuus are antioxidant enzymes with phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase and thioredoxin peroxidase activities[J]. European Journal of Biochemistry， 2002，269（9）：2414-2420.

[4] CRIQUI M， JAMET E， PARMENTIER Y， et al. Isolation and characterization of a plant cDNA showing homology to animal glutathione peroxidases[J].Plant Molecular Biology，1992，18（3）：623-627.

[5] LI W J， FENG H， FAN J H， et al. Molecular cloning and expression of a phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase homolog in Oryza sativa[J]. Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Gene Structure and Expression，2000，1493（1）：225-230.

[6] HOLLAND D， BEN-HAYYIM G， FALTIN Z， et al. Molecular characterization of salt-stress-associated protein in citrus： Protein and cDNA sequence homology to mammalian glutathione peroxidases[J]. Plant Molecular Biology，1993，21（5）：923-927.

[7] DEPEGE N， DREVET J， BOYER N. Molecular cloning and characterization of tomato cDNAs encoding glutathione peroxidase-like proteins[J]. European Journal of Biochemistry，2001， 253（2）：445-451.

[8] MIAO Y， LV D， WANG P， et al. An Arabidopsis glutathione peroxidase functions as both a redox transducer and a scavenger in abscisic acid and drought stress responses[J]. The Plant Cell，2006，18（10）：2749-2766.

[9] GOLDENKOVA I， MUSIYCHUK K， PIRUZIAN E. Bifunctional reporter genes： Construction and expression in prokaryotic and eukaryotic cells[J]. Molecular Biology，2003，37（2）：307-313.

[10] QUAEDVLIEG N E， SCHLAMAN H R， ADMIRAAL P C， et al. Fusions between green fluorescent protein and β-glucuronidase as sensitive and vital bifunctional reporters in plants[J]. Plant Molecular Biology，1998，38（5）：861-873.

[11] AMTMANN A， BOHNERT H J， BRESSAN R A. Abiotic stress and plant genome evolution. Search for new models[J]. Plant Physiology，2005，138（1）：127-130.