利瑪原甲藻形態(tài)特征及生活史的研究

摘要：利用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡對(duì)利瑪原甲藻（Procentrum lima）形態(tài)特征及生活史進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明，其細(xì)胞呈卵圓形，長33～44 μm，寬23～33 μm，殼孔62～87個(gè)，邊緣刺胞孔52～68個(gè)。同時(shí)，對(duì)其生活周期及生殖方式進(jìn)行了追蹤觀察，不同的生活周期存在著不同的細(xì)胞形態(tài)。二分裂是利瑪原甲藻主要的分裂方式，并首次發(fā)現(xiàn)利瑪原甲藻疑似橫分裂、出芽生殖的生殖方式。利瑪原甲藻面對(duì)不良環(huán)境時(shí)會(huì)形成薄壁囊胞。

關(guān)鍵詞：利瑪原甲藻（Procentrum lima）；形態(tài)特征；生活史；無性生殖；有性生殖

中圖分類號(hào)：P745；S917.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）11-2607-05

利瑪原甲藻（Procentrum lima）是一種能產(chǎn)生毒素的底棲附生甲藻，分布于熱帶和溫帶沿海水域，是構(gòu)成海洋生態(tài)系統(tǒng)的基礎(chǔ)，是浮游動(dòng)物的食物來源[1-5]。利瑪原甲藻具有特殊的生理機(jī)制，能產(chǎn)生一系列的次生代謝產(chǎn)物，如腹瀉性貝毒。該毒素被魚、蝦、貝攝食后在其體內(nèi)積累，并通過食物鏈傳遞至人類，引起腹瀉性中毒。腹瀉性貝類中毒現(xiàn)象普遍存在，已被列為世界食品衛(wèi)生學(xué)重要問題之一，并引起世界上許多國家及相關(guān)國際組織高度重視。除了帶來食品安全隱患外，腹瀉性貝毒還具有抑制蛋白磷酸酶活性、遺傳毒性、促癌活性、促瘤活性、抑癌和抗瘤活性、藥理活性等特性[6-9]。

目前，對(duì)利瑪原甲藻形態(tài)、生長、生理、產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)等方面有許多研究[1-5，10-17]。然而，有關(guān)利瑪原甲藻生活史及其環(huán)境關(guān)系方面的研究還未見報(bào)道。球狀棕囊藻生活史中共有4種不同類型的單細(xì)胞，不同的細(xì)胞能夠適應(yīng)不同的環(huán)境，占據(jù)不同的生態(tài)位，有利于棕囊藻細(xì)胞的生長[18]。孢囊是藻類處于不良環(huán)境時(shí)形成的一種細(xì)胞形態(tài)，被認(rèn)為是赤潮發(fā)生的“種源”之一[19，20]，對(duì)赤潮的發(fā)生、延續(xù)和消亡過程有著重要的作用。利瑪原甲藻是否亦存在多種細(xì)胞類型？這些不同類型的細(xì)胞與環(huán)境存在什么聯(lián)系？利瑪原甲藻是否也能形成孢囊，作為形成赤潮的潛在因素？本研究對(duì)利瑪原甲藻生活史進(jìn)行了觀察，為進(jìn)一步研究利瑪原甲藻與環(huán)境的關(guān)系打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

利瑪原甲藻采自海南省三亞市，經(jīng)分離純化后，保存于中國科學(xué)院南海海洋研究所廣東省海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保種室。利瑪原甲藻在溫度30 ℃、鹽度35‰、光照強(qiáng)度3 500 lx、光照周期13 h∶11 h的環(huán)境條件下采用改良K培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2 形態(tài)觀察

1.2.1 光學(xué)顯微鏡觀察 吸取利瑪原甲藻培養(yǎng)液至Nikon-TS100倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2 電子顯微鏡觀察 取20 mL利瑪原甲藻培養(yǎng)液，加入4%甲醛固定24 h，800 r/min離心5 min后棄上清；加入ddH2O洗滌后，800 r/min離心5 min后棄上清以去鹽；加入2 mL 50%鋨酸固定4～6 h；800 r/min離心5 min后棄上清，加ddH2O再洗滌，重復(fù)3次以去除鋨酸。離心后的沉淀物分別進(jìn)行乙醇梯度（30%、50%、70%、90%、95%）脫水處理。保持濕潤狀態(tài)進(jìn)行電鏡前處理，加入適量乙酸異戊酯置換乙醇，然后用液體CO2進(jìn)行常規(guī)干燥。干燥后輕柔抖動(dòng)濾紙，使藻末散落至膠膜上，HITACHI E-1010型離子濺射儀噴鍍金膜，用HITACHI S-3400N掃描電鏡觀察并攝影。

1.3 生活周期及生殖方式觀察

將藻株接種至新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)方法按照“1.1”方法，每天定時(shí)取樣觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡下利瑪原甲藻的形態(tài)

利瑪原甲藻在光學(xué)顯微鏡下呈黃綠色、卵圓形，細(xì)胞中央的淀粉核清晰可見，周圍散布著顆粒狀的淀粉粒和葉綠體（圖1a）。淀粉核與頂孔之間可見大液泡（圖1b），指數(shù)生長初期大液泡尤為明顯。細(xì)胞內(nèi)容物外泄后形成空殼（圖1c），殼板上刺胞孔隱約可見，邊緣刺胞孔繞細(xì)胞外圍整齊排列。利瑪原甲藻由左、右兩個(gè)殼板組成（圖1d），殼板厚而光滑，表面分布著殼孔。邊緣刺胞孔均勻分布在殼板的四周，邊緣刺胞孔是利瑪原甲藻區(qū)別于其他原甲藻的重要特征。殼板連接至邊緣刺胞孔處表面光滑，無殼孔分布（圖1e、1i）。右殼板頂端的V形凹陷是其明顯的標(biāo)志（圖1f）。V形頂孔由8個(gè)小板、1個(gè)較大的鞭毛孔及1個(gè)較小的輔孔組成（圖1g），兩根鞭毛由鞭毛孔處伸出，突起的鞭毛骨架包圍著輔孔，頂孔至殼板中央的中軸稍有凹陷，殼板中央無刺胞孔。左殼板與右殼板不同，在頂端無V形凹陷，只有個(gè)扁平的頂脊區(qū)與鞭毛孔相連，中軸處未下凹，其中央的一小片區(qū)域也沒有刺胞孔的分布（圖1h）。利瑪原甲藻側(cè)面圖呈扁圓形，細(xì)胞長33～44 μm，寬23～33 μm，殼孔62～87個(gè)，邊緣刺胞孔52～68個(gè)。

2.2 利瑪原甲藻的生活周期

指數(shù)生長期的利瑪原甲藻液泡特別明顯（圖2a），與穩(wěn)定期的利瑪原甲藻相比，絕大部分的細(xì)胞有既大又亮的液泡，而且常常不止1個(gè)。由于液泡是物質(zhì)的存儲(chǔ)場所，在指數(shù)生長初期，細(xì)胞內(nèi)合成的各種為分裂所準(zhǔn)備的物質(zhì)大多存儲(chǔ)在液泡內(nèi)，使得此時(shí)的液泡既大又亮。指數(shù)生長初期亦可見某些細(xì)胞底部膨大，呈梨狀，染色體所在位置顏色明顯加深（圖2b）。當(dāng)利瑪原甲藻到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)，由于營養(yǎng)匱乏，有的細(xì)胞會(huì)發(fā)生殼壁分離，處于休眠狀態(tài)（圖2c）；也有的細(xì)胞會(huì)發(fā)生內(nèi)容物外泄（圖2d）。內(nèi)容物外泄后的細(xì)胞顏色變淡或無色（圖2e），左右殼板會(huì)發(fā)生分裂（圖2f）。此外，在穩(wěn)定期常常看到1對(duì)細(xì)胞被包裹在透明的囊膜里（圖2g），這是為了適應(yīng)不良環(huán)境而形成的，穩(wěn)定期水體中的營養(yǎng)成分不足以維持新生細(xì)胞的生長需要。生長末期，細(xì)胞顏色變深，形狀變得不規(guī)則，淀粉核消失，邊緣刺孢孔變得不明顯（圖2h、2i）。

剛接種時(shí)（延滯期），大多數(shù)細(xì)胞緊貼在瓶底，只有極少的細(xì)胞連接形成絮狀懸?。▓D3a）。幾天后（指數(shù)生長前期）貼在瓶底的細(xì)胞逐漸適應(yīng)新環(huán)境，部分細(xì)胞開始連接在一起，呈懸浮狀，由于生長較活躍，會(huì)有一些小氣泡（圖3b）。細(xì)胞貼底現(xiàn)象消失，利瑪原甲藻在搖動(dòng)后形成絲狀或片狀懸浮，并有很多氣泡（圖3c）。因此，液泡和氣泡與利瑪原甲藻的細(xì)胞分裂密切相關(guān)，可作為觀察利瑪原甲藻生長活躍的標(biāo)志。穩(wěn)定期時(shí)懸浮細(xì)胞減少，絕大部分沉底，沒有氣泡（圖3d）。

2.3 利瑪原甲藻的生殖方式

利瑪原甲藻既可無性繁殖又可有性生殖，無性繁殖以二分裂為主，也會(huì)出現(xiàn)疑似橫分裂和出芽生殖的生殖形式。

1）利瑪原甲藻的二分裂先是進(jìn)行核分裂，然后進(jìn)行質(zhì)分裂。分裂時(shí)，兩個(gè)殼板之間的中間帶變寬（圖4a），細(xì)胞底部出現(xiàn)分叉（圖4b），呈“V”形。每個(gè)子細(xì)胞在分裂過程中均合成1個(gè)新殼板，即每個(gè)細(xì)胞均有1塊來自原母細(xì)胞的殼板和1塊新合成的殼板。當(dāng)兩個(gè)子細(xì)胞還沒分裂完全時(shí)，第三個(gè)細(xì)胞在兩個(gè)子細(xì)胞之間開始形成“爪”形的三胞體（圖4c）。頂部鞭毛和游動(dòng)細(xì)胞的出現(xiàn)標(biāo)志著分裂完成。

2）利瑪原甲藻培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)疑似橫分裂的生殖方式。首先是細(xì)胞橫軸的一端出現(xiàn)凹陷，此時(shí)淀粉核消失（圖4d），然后另一端也發(fā)生凹陷，在細(xì)胞底部形成一片顏色較暗的物質(zhì)（圖4e），接著在細(xì)胞上、下部分的中央形成兩個(gè)新的淀粉核（圖4f），最后細(xì)胞的鞭毛孔與底部處分開（圖4g），在將要分離的連接處可看到透明的薄膜。利瑪原甲藻疑似出芽生殖的現(xiàn)象首次被發(fā)現(xiàn)，小芽孢出自母體接近細(xì)胞核的底端，處于母細(xì)胞中央的淀粉核清晰可見（圖4h、4i）。

3）利瑪原甲藻的有性生殖是同配生殖。配子外壁脫落后比正常細(xì)胞略小，通過受精橋進(jìn)行固定（圖4j），當(dāng)配子固定后受精橋消失，細(xì)胞核從供體轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，接著形成大合子（圖4k），該過程與Faust[21]的報(bào)道一致。休眠細(xì)胞處于合子的旁邊，呈圓形，約為合子的1/3～1/2，邊緣刺胞孔消失，外壁明顯變厚。合子的休眠期很短，當(dāng)原生質(zhì)出現(xiàn)，合子開始脫孢囊，形成葉綠素，然后胞質(zhì)分裂（圖4l）。

3 小結(jié)與討論

1）利瑪原甲藻整個(gè)生活周期存在游離的單細(xì)胞和群體細(xì)胞兩種生活形態(tài)。在剛接種的生長初期，密度小、游動(dòng)的單細(xì)胞占優(yōu)勢；到了指數(shù)生長期，絕大部分的細(xì)胞連接在一起形成絲狀或絮狀懸浮，群體細(xì)胞占了絕對(duì)優(yōu)勢；穩(wěn)定期后期，細(xì)胞沉在底部，有游離的單細(xì)胞，也有被絮狀物黏在一起的群體細(xì)胞。利瑪原甲藻體積較大，大多數(shù)單細(xì)胞只能沉在底部緩慢游動(dòng)，影響光吸收，而細(xì)胞連接成絲或絮狀懸浮在培養(yǎng)液中，大大有利于光合作用。因而懸浮的細(xì)胞群體常常伴隨有較多較大的氣泡。

2）利瑪原甲藻的生殖方式較為復(fù)雜，在生長前期營養(yǎng)良好的環(huán)境條件下以無性繁殖為主，在生長后期營養(yǎng)較匱乏時(shí)可觀察到有性繁殖。不同藻類主要生殖方式不同，有性生殖是球狀棕囊藻主要的生殖方式[18]，而利瑪原甲藻主要生殖方式是無性生殖。有毒赤潮藻種（Pfiesteria piscicida）無性生殖的分裂發(fā)生在孢囊里，并非由游動(dòng)細(xì)胞直接分裂而來[22]，擬膝溝亞歷山大藻（Alexandrium pseudogonyaulax）也可以形成暫時(shí)性孢囊進(jìn)行分裂[23]。利瑪原甲藻無性生殖方式有發(fā)生在暫時(shí)性孢囊里的分裂，也有由游動(dòng)細(xì)胞直接產(chǎn)生子細(xì)胞的分裂。

3）目前，對(duì)甲藻生活史研究較多的是孢囊。甲藻孢囊的形成有利于營養(yǎng)細(xì)胞在不良環(huán)境下度過逆境階段，而且比營養(yǎng)細(xì)胞和休眠細(xì)胞更有利于抵御浮游動(dòng)物的捕食， 甚至隨浮游動(dòng)物的糞便排出后仍可萌發(fā)，這些現(xiàn)象對(duì)于赤潮的引發(fā)、種群的保存、延續(xù)以及分布擴(kuò)散等均具有重要的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)意義[24，25]。孢囊形成一般認(rèn)為受營養(yǎng)鹽和溫度兩方面因素的影響。野外采集觀察發(fā)現(xiàn)孢囊形成常是由于溫度降低所誘導(dǎo)，低氮營養(yǎng)可誘導(dǎo)孢囊形成已被室內(nèi)培養(yǎng)所證實(shí)[26-28]。本研究中利瑪原甲藻恒溫培養(yǎng)，孢囊是在生長穩(wěn)定期或者末期被觀察到，因此，其孢囊的形成與營養(yǎng)鹽的缺乏密切相關(guān)。

本研究對(duì)利瑪原甲藻生活史展開追蹤和觀察，較為全面地觀測和記錄到其生活形態(tài)和生殖方式。多個(gè)細(xì)胞裹在一個(gè)孢囊的繁殖方式或許能加快種群的繁殖速度。首次發(fā)現(xiàn)疑似橫分裂、出芽生殖這些獨(dú)特的生殖方式和休眠細(xì)胞，豐富了細(xì)胞形態(tài)學(xué)和利瑪原甲藻生活史的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] BRAVO I，F(xiàn)EMANDEZ M L，RAMILO I，et al. Toxin composition of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast（NW Spain）[J]. Toxicon，2001，39（10）：1537-1545.

[2] FAUST M A. Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima （Pyrrophyta） from widely differing sites[J]. Journal of Phycology，1991，27（5）：642-648.

[3] CARLSON R D，TINDALL D R. Distribution and periodicity of toxic dinoflagellates in the Virgin Islands[A]. ANDERSON D M，WHITE A W，BADEN D G. Toxic Dinoflagellates[M]. New York：Academic Press，1985.171-176.

[4] MARANDA L，CORWIN S，HARGRAVES P E. Prorocentrum lima（Dinophyceae） in northeastern USA coastal waters I： Abundance and distribution[J]. Harmful Algae，2007，6（5）：623-631.

[5] MARANDA L， CORWIN S， DOVER S. Prorocentrum lima （Dinophyceae） in northeastern USA coastal waters II： Toxin load in the epibiota and in shellfish[J]. Harmful Algae，2007， 6（5）：632-641.

[6] COHEN P，HOLMES C F，TSUKITANI Y. Okadaic acid： a new probe for the study of cellular regulation[J]. Trends in Biochemical Sciences， 1990，15（3）：98-102.

[7] FESSARD V， GROSSE Y， PFOHL-LESZKOWICZ A，et al. Okadaic acid treatment induces DNA adduct formation in BHK21 C13 fibroblasts and HESV keratinocytes[J]. Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects，1996，361（2-3）：133-141.

[8] FUJIKI H，SUGANUMA M. Unique features of the okadaic acid activity class of tumor promoters[J]. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology，1999，125（3-4）：150-155.

[9] 陳 洋. DSP等赤潮藻毒素對(duì)哺乳類細(xì)胞的毒性效應(yīng)及機(jī)制研究[D]. 山東青島：中國科學(xué)院海洋研究所，2008.

[10] 徐 杏. 關(guān)鍵環(huán)境因子對(duì)利瑪原甲藻的生長和產(chǎn)毒影響的研究[D]. 山東青島：中國海洋大學(xué)，2009.

[11] 曾 玲，龍麗娟，龍 超. 光照周期、溫度和起始密度對(duì)利瑪原甲藻（三亞株）生長的影響[J]. 熱帶海洋學(xué)報(bào)，2010，29（6）：137-142.

[12] 曾 玲，何偉宏，龍 超，等. 環(huán)境因子對(duì)利瑪原甲藻（Prorocentrum lima）產(chǎn)毒影響的初步研究[J]. 中國海洋藥物，2010， 29（6）：21-28.

[13] 邱德全，林永水，周近明，等. 利瑪原甲藻腹瀉毒素的生物學(xué)測定[J]. 熱帶海洋，1996，15（4）：46-49.

[14] 吳建欣. 利瑪原甲藻的黑海綿酸釋放與提純最佳化研究[D]. 臺(tái)北：國立臺(tái)灣大學(xué)生命科學(xué)院漁業(yè)科學(xué)研究所，2007.

[15] 吳 軍，林永水，劉寧寧. Prorocentrum lima的生長特性研究[A]. 中國科學(xué)院南海海洋研究所南海實(shí)驗(yàn)站.熱帶海洋研究（五）[M]. 北京：海洋出版社，1997.9-16.

[16] 楊維東，鐘 娜，劉潔生，等. 不同磷源及濃度對(duì)利瑪原甲藻生長和產(chǎn)毒的影響研究[J]. 環(huán)境科學(xué)，2008，29（10）：2760-2765.

[17] 鐘 娜，楊維東，劉潔生，等.不同氮源對(duì)利瑪原甲藻（Prorocentrum lima）生長和產(chǎn)毒的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28（6）：1186-1191.

[18] 王宗靈，黎 慧，高春雷. 球狀棕囊藻的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生活史及生態(tài)意義研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)科學(xué)，2009，28（1）：90-96.

[19] DALE B. Dinoflagellate Resting Cysts： Benthic Plankton[M]. Cambridge：Cambridge University Press，1983.69-136.

[20] 黃海燕，陸斗定.甲藻孢囊研究進(jìn)展[J]. 海洋學(xué)研究，2009， 27（3）：85-92.

[21] FAUST M A. Alternate asexual reproduction of Prorocentrum lima in culture[A]. SMAYDA T J，SHIMIZU Y. Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea[M]. New York：Academic Press，1993.115-126.

[22] LITAKER R W，VANDERSEA M W，KIBLER S R. Life cycle of the heterotrophic dinoflagellate Pfiesteria Piscicida（dinophyceae）[J]. Journal of Phycology，2002，38（3）：442-463.

[23] MONTRESOR M. The life history of Alexandrium pseudogonyaulax（Gonyaulacales，Dinophyceae）[J]. Phycology，1995， 34（6）：444-448.

[24] 鄭 磊，齊雨藻.赤潮甲藻孢囊研究綜述[J]. 暨南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1995，16（1）：137-149.

[25] BINER B J，ANDERSON D M. Physiological and environmental control of germination in Scrippsie trochoidea（Dinophyceae） resting cysts[J]. Journal of Phycology，1987，23（2）：99-107.

[26] CHEN C P， SUN L， GAO Y H， et al. Seasonal changes of viable diatom resting stages in bottom sediments of Xiamen Bay，China[J]. Journal of Sea Research，2009，61（3）：125-132.

[27] ANDERSON D M，AUBREY D G，TYLER M A. Vertical and horizontal distributions of dinoflagellate cysts in sediments[J]. Limnology Oceanography，1982，27（4）：757-765.

[28] 孫 琳，高亞輝，陳長平，等.氮、硅限制對(duì)赤潮藻扁面角毛藻休眠孢子形成的影響[J]. 植物學(xué)報(bào)，2009，44（5）：601-607.