三種羥肟酸捕收劑的微生物降解研究

摘要：采用搖瓶振蕩法研究克雷伯氏菌屬（Klebsiella）微生物對(duì)2-羥基-3-萘甲羥肟酸、苯甲羥肟酸和水楊羥肟酸3種常見(jiàn)的羥肟酸類捕收劑的生物降解。試驗(yàn)結(jié)果表明，該微生物對(duì)此類捕收劑具有較好的降解效果。捕收劑被微生物降解12 d后，模擬廢水中2-羥基-3-萘甲羥肟酸的降解率為44.56%，苯甲羥肟酸的降解率為85.04%，水楊羥肟酸的降解率為62.04%。降解過(guò)程中，廢水中的OD600 nm均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，表明微生物在降解過(guò)程初期大量生長(zhǎng)繁殖，隨后由于降解作用致使廢水中可供利用的碳源減少，導(dǎo)致微生物大量衰亡。

關(guān)鍵詞：羥肟酸；捕收劑；微生物降解；細(xì)菌細(xì)胞密度

中圖分類號(hào)：X703 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）11-2505-03

羥肟酸（Hydroxamic acid）又稱氧肟酸或異羥肟酸，其通式為RC（O）NHOH，可看成是羧酸的衍生物[1]。羥肟酸是一種相當(dāng)活潑的有機(jī)弱酸，通常以酮式和醇式2種互變異構(gòu)體的形式存在，即羥肟酸和異羥肟酸同時(shí)存在，二者可被認(rèn)為是同一種物質(zhì)，光譜數(shù)據(jù)證明兩種異構(gòu)體中酮式是主要的存在形式[2]。

由于羥肟酸分子中含有氮原子和氧原子，它們都存在孤對(duì)電子，這樣特殊結(jié)構(gòu)的存在使得羥肟酸很容易和金屬陽(yáng)離子發(fā)生配位，形成很穩(wěn)定的五元環(huán)或六元環(huán)狀螯合物[3]。因此羥肟酸被應(yīng)用于礦物加工行業(yè)中，如在氧化鉛鋅礦、氧化銅礦、稀土礦的浮選中被大量用作捕收劑[4]。而其中羥肟酸對(duì)稀土礦，如獨(dú)居石、氟碳鈰礦和磷釔礦等的浮選是最有效的捕收劑[5]。早在1940年P(guān)opperle就已經(jīng)將羥肟酸及其鹽類捕收劑用于礦物的浮選中，并在德國(guó)獲得了專利權(quán)[6]。目前羥肟酸廣泛應(yīng)用于鎢礦、錫石、氧化銅礦、氧化鋅礦等礦的浮選中， 羥肟酸取得了較好的選別指標(biāo)， 在礦物加工領(lǐng)域中具有較大的發(fā)展空間。此外，羥肟酸在醫(yī)藥和生化領(lǐng)域也有一定的應(yīng)用，可作為基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、抗癌藥物、抗腫瘤藥物、除草劑、殺菌劑等[6]。

2-羥基-3-萘甲羥肟酸、苯甲羥肟酸和水楊羥肟酸是3種常見(jiàn)的羥肟酸類捕收劑，其中苯甲羥肟酸和水楊羥肟酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)中都含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，2-羥基-3-萘甲羥肟酸中含有更加穩(wěn)定的萘環(huán)結(jié)構(gòu)。羥肟酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)使得其作為捕收劑使用在環(huán)境中富集后會(huì)具有一定的生理毒性，并且會(huì)增加礦物加工過(guò)程中廢水的COD，也會(huì)將N元素引入水體，在水體中累積后會(huì)引起水體富營(yíng)養(yǎng)化，給環(huán)境造成影響。羥肟酸屬于較難降解的有機(jī)物，一旦排放到環(huán)境中，它們難于被分解，所以可以在水體、土壤等環(huán)境介質(zhì)中存留數(shù)年甚至更長(zhǎng)的時(shí)間。因此，為了降低羥肟酸捕收劑在環(huán)境中的影響程度，研究了3種常見(jiàn)羥肟酸類捕收劑的微生物降解性能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料 試驗(yàn)選用3種常見(jiàn)羥肟酸類捕收劑，具體見(jiàn)表1。

1.1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 MgSO4·7H2O 0.2 g、（NH4）2SO4 0.5 g、NaCl 1.0 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 1.5 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.1.3 模擬廢水的制備 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加2-羥基-3-萘甲羥肟酸、苯甲羥肟酸和水楊羥肟酸3種捕收劑人工配制成模擬廢水，廢水中羥肟酸捕收劑的濃度均為100 mg/L。

1.1.4 菌種來(lái)源 由武漢理工大學(xué)從某地土壤中分離出的一株克雷伯氏菌屬（Klebsiella）微生物。

1.1.5 所用儀器 HZQ-C雙層空氣恒溫振蕩器、UV-3000PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、Sartorius BS210S型電子天平、LG10-2.4A型高速離心機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 羥肟酸捕收劑的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 用UV-3000PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)3種羥肟酸廢水溶液作全程掃描，確定最大特征吸收峰波長(zhǎng)。配制不同濃度的模擬廢水溶液， 在最大特征吸收峰波長(zhǎng)下以蒸餾水為空白對(duì)照測(cè)定溶液的吸光度，得到模擬廢水溶液濃度與吸光度之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.2 微生物懸浮液的制備 在以H205為惟一碳源的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)克雷伯氏菌72 h后，將平板上的菌落用接種環(huán)挑取轉(zhuǎn)接至pH 7.2磷酸緩沖溶液中，配制成細(xì)菌細(xì)胞密度為108個(gè)/mL的菌懸液，備用。

1.2.3 微生物降解羥肟酸的試驗(yàn) 在3種人工模擬廢水中按照10%的體積比添加微生物懸浮液，將配制好的上述混合液分別取100 mL分裝于250 mL的錐形瓶中，置于HZQ-C雙層空氣恒溫振蕩器內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為150 r/min、溫度為30 ℃的條件下進(jìn)行微生物降解試驗(yàn)。分別在降解0、3、5、7、9、12 d時(shí)取出一定量的模擬廢水，在轉(zhuǎn)速為7 500 r/min的條件下離心分離15 min，稀釋后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定上清液中待測(cè)物質(zhì)羥肟酸捕收劑的吸光度，據(jù)此計(jì)算溶液中羥肟酸捕收劑的濃度。羥肟酸捕收劑的降解率計(jì)算公式為：

D=（C0-Cn）/C0×100%

式中，D為第n天的降解率；C0為降解開(kāi)始時(shí)廢水中羥肟酸捕收劑的濃度，mg/L；Cn為降解第n天時(shí)廢水中羥肟酸捕收劑的濃度，mg/L。

1.2.4 細(xì)菌細(xì)胞密度（OD600 nm） OD600 nm是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定羥肟酸捕收劑模擬廢水在微生物降解過(guò)程中600 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 2-羥基-3-萘甲羥肟酸的微生物降解效果

圖1為2-羥基-3-萘甲羥肟酸降解率及OD600 nm隨時(shí)間的變化，從圖1可以看出，微生物對(duì)2-羥基-3-萘甲羥肟酸捕收劑的降解具有一定的作用，模擬廢水中2-羥基-3-萘甲羥肟酸的降解率隨降解時(shí)間的推移逐漸增加，降解12 d時(shí)2-羥基-3-萘甲羥肟酸捕收劑的降解率達(dá)到了44.56%。OD600 nm的變化趨勢(shì)表明微生物在該捕收劑廢水中的生長(zhǎng)情況，微生物降解2-羥基-3-萘甲羥肟酸捕收劑過(guò)程中OD600 nm的變化趨勢(shì)是先升高后降低。在開(kāi)始的時(shí)候由于細(xì)菌大量的生長(zhǎng)繁殖，在微生物降解苯甲羥肟酸5 d時(shí)細(xì)菌的OD600 nm由初始狀態(tài)的0.092達(dá)到最大值0.174；隨后由于廢水中作為碳源被利用的2-羥基-3-萘甲羥肟酸的量逐漸減小，導(dǎo)致微生物由于營(yíng)養(yǎng)不足大量死亡或者自溶，在微生物降解12 d時(shí)OD600降低到0.078。2-羥基-3-萘甲羥肟酸捕收劑在微生物的降解過(guò)程中，一部分有機(jī)物被微生物攝取后通過(guò)代謝活動(dòng)被分解、穩(wěn)定，并提供其生理活動(dòng)所需的能量；另一部分有機(jī)物被微生物轉(zhuǎn)化，合成為新的原生質(zhì)，即進(jìn)行微生物的生長(zhǎng)繁殖。

2.2 苯甲羥肟酸的微生物降解效果

圖2為苯甲羥肟酸降解率及OD600 nm隨時(shí)間的變化，可見(jiàn)微生物對(duì)苯甲羥肟酸捕收劑的降解具有較明顯的作用。微生物降解12 d時(shí)模擬廢水中苯甲羥肟酸的降解率逐漸上升，最終達(dá)到了85.04%。苯甲羥肟酸捕收劑的生物降解效果比2-羥基-3-萘甲羥肟酸要好，原因是苯甲羥肟酸只含有1個(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)，相對(duì)于含有萘環(huán)結(jié)構(gòu)的2-羥基-3-萘甲羥肟酸來(lái)講，苯環(huán)結(jié)構(gòu)更容易開(kāi)環(huán)，所以更容易被微生物降解。苯甲羥肟酸模擬廢水中的OD600 nm的變化趨勢(shì)與2-羥基-3-萘甲羥肟酸相同，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，微生物降解苯甲羥肟酸5 d時(shí)細(xì)菌OD600 nm由初始狀態(tài)的0.092達(dá)到最大值0.280，隨后逐漸降低到12 d時(shí)的0.164。

2.3 水楊羥肟酸的微生物降解效果

圖3為水楊羥肟酸降解率及OD600 nm隨時(shí)間的變化。由圖3可知，微生物對(duì)水楊羥肟酸的降解效果較好，模擬廢水中水楊羥肟酸捕收劑經(jīng)過(guò)微生物降解12 d時(shí)降解率為62.04%。微生物在降解捕收劑的周期中，OD600 nm在降解3 d時(shí)上升到最大值，為0.218，隨后逐漸下降到12 d時(shí)的0.128。

3 結(jié)論

1）采用振蕩法用克雷伯氏菌屬微生物對(duì)2-羥基-3-萘甲羥肟酸、苯甲羥肟酸和水楊羥肟酸3種常見(jiàn)的羥肟酸類捕收劑進(jìn)行生物降解，試驗(yàn)結(jié)果表明克雷伯氏菌屬微生物對(duì)此類捕收劑具有一定的降解效果。

2）在微生物降解12 d時(shí)，模擬廢水中2-羥基-3-萘甲羥肟酸的降解率為44.56%，苯甲羥肟酸的降解率為85.04%，水楊羥肟酸的降解率為62.04%?？梢?jiàn)，由于2-羥基-3-萘甲羥肟酸具有較為穩(wěn)定的萘環(huán)結(jié)構(gòu)，所以這種捕收劑較難降解。

3）在3種羥肟酸類捕收劑的微生物降解過(guò)程中，模擬廢水的OD600 nm均先升高后降低，表明微生物在降解過(guò)程初期大量生長(zhǎng)繁殖，隨后由于廢水中可供利用的碳源減少，導(dǎo)致微生物大量衰亡。

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