AcMNPV e18基因酵母雙雜交誘餌載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄自激活檢測(cè)

摘要：用PCR方法擴(kuò)增苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）被膜蛋白ODV-E18基因，克隆至酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-e18。將誘餌質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187和AH109感受態(tài)細(xì)胞，被轉(zhuǎn)化細(xì)胞在涂有X-gal的SD/-Trp營(yíng)養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基上形成白色菌落；在SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade固體培養(yǎng)基上均不形成菌落，表明誘餌基因表達(dá)產(chǎn)物BD-E18在這兩種細(xì)胞中都不能激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄。pGBKT7-e18轉(zhuǎn)化的Y187細(xì)胞在SD/-Trp營(yíng)養(yǎng)缺陷型液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度與空載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞相同，顯示BD-E18對(duì)酵母細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，AcMNPV ODV-E18可能不直接參與對(duì)宿主細(xì)胞或病毒基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，其編碼基因可以作為誘餌基因通過(guò)篩查病毒宿主cDNA文庫(kù)識(shí)別與其相互作用的蛋白質(zhì)。

關(guān)鍵詞：苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）；ODV-E18；酵母雙雜交；自激活；細(xì)胞毒性

中圖分類(lèi)號(hào)：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）10-2436-03

苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）是α-屬桿狀病毒的代表種，感染30多種鱗翅目昆蟲(chóng)，是目前研究得最多的桿狀病毒種[1]。AcMNPV在其復(fù)制周期中產(chǎn)生兩種結(jié)構(gòu)和功能不同的病毒體：包含體源病毒體（ODV）和芽殖病毒體（BV）。ODV和BV分別執(zhí)行病毒在宿主種群個(gè)體間的傳遞和受感染蟲(chóng)體內(nèi)的系統(tǒng)感染功能[2]。這兩種病毒體包含序列相同的基因組，但蛋白質(zhì)組成存在差異。目前已經(jīng)鑒定出40多種AcMNPV ODV結(jié)構(gòu)蛋白和相似數(shù)目的BV結(jié)構(gòu)蛋白。其中33種結(jié)構(gòu)蛋白共存于ODV和BV病毒體，ODV和BV各有10多種特有蛋白質(zhì)[3，4]。

AcMNPV ODV-E18最初被發(fā)現(xiàn)是一種ODV被膜蛋白[5]。最近的研究報(bào)道表明，該蛋白質(zhì)也存在于BV被膜[4]。e18基因存在于所有已完成測(cè)序的桿狀病毒基因組，是桿狀病毒33個(gè)核心基因之一。缺e18基因的AcMNPV基因組在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)不能完成BV復(fù)制[6]。其作用機(jī)制尚未明了。為了解e18基因在桿狀病毒復(fù)制過(guò)程中的作用，擬通過(guò)酵母雙雜交篩選與ODV-E18相互作用的宿主細(xì)胞蛋白。研究克隆了AcMNPV e18基因開(kāi)放閱讀框，構(gòu)建了誘餌載體并完成了其在酵母細(xì)胞中的自激活和毒性檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

AcMNPV、酵母AH109和Y187菌株、pGBKT7質(zhì)粒（購(gòu)自美國(guó)Clontech公司）由華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，SD/-Trp、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，DNA限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自Fermentas（MBI）公司，T4 DNA連接酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，Pfu DNA聚合酶購(gòu)自北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 e18 基因PCR擴(kuò)增和誘餌載體的構(gòu)建 根據(jù)AcMNPV基因組序列[7]設(shè)計(jì)e18基因開(kāi)放閱讀框（nt 125153-125341）的上游引物e18 UP：5′-GGCGAATTCATGTTCTTGACCATCTTG-3′和下游引物e18 DN：5′-CTTGCTGCAGTGACCGTTCGAACTT

TG-3′，以AcMNPV DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。e18 UP和e18 DN分別對(duì)應(yīng)AcMNPV基因組序列nt 125153-125170和nt 125376-125394。兩者分別附加EcoR I和Pst I限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別序列。用EcoR I和Pst I分別雙酶切e18基因的PCR產(chǎn)物和pGBKT7載體，將回收的酶切載體和PCR片段進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)成誘餌載體pGBKT7-e18。

1.2.2 酵母菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備及誘餌載體的轉(zhuǎn)化 在YPDA固體培養(yǎng)基平板上劃線活化釀酒酵母Y187菌株和AH109菌株，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～4 d；挑取生長(zhǎng)狀況良好的單菌落接種于3 mL的YPDA液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)8 h；從中取4 μL的菌液接種到25 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、250 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)14～20 h，至OD600 nm達(dá)到0.15～0.30；離心、棄上清，將細(xì)胞沉淀重新懸浮于50 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、250 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3～6 h，至OD600 nm達(dá)到0.40～0.50。離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞沉淀懸浮于30 mL無(wú)菌去離子水；離心、棄上清，用1.5 mL 1.1×TE/LiAc溶液重懸酵母菌體，將其轉(zhuǎn)移到1.5 mL的Eppendorf管中，以12 000 r/min離心15 s，棄上清，再用600 μL的1.1×TE/LiAc溶液重懸酵母菌體；置冰上，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。

向預(yù)冷的Eppendorf管中分別加入500 μL PEG/LiAc溶液、50 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞、5 μL變性鮭魚(yú)精子DNA、2 μL誘餌載體，充分混勻，于30 ℃水浴30 min，然后加入20 mL DMSO，于42 ℃水浴15 min，以12 000 r/min離心15 s，棄上清，用1 mL YPDA培養(yǎng)基重懸菌體，于30 ℃、200 r/min 90 min，以12 000 r/min離心15 s，棄上清，用9 g/L NaCl溶液重懸菌體，涂布平板。

1.2.3 自激活活性的檢測(cè) 用pGBKT7-e18分別轉(zhuǎn)化Y187和AH109細(xì)胞，用無(wú)菌的 9 g/L NaCl溶液重懸菌體后，并按10-1、10-2、10-3、10-4梯度稀釋?zhuān)謩e取100 μL的10-2、10-3、10-4梯度的菌液涂布到含X-gal的SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade營(yíng)養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基平板上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況和顏色反應(yīng)。

1.2.4 細(xì)胞毒性檢測(cè) 挑取在SD/-Trp固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的含有pGBKT7-e18或pGBKT7的Y187單菌落，分別接種到50 mL含有20 mg/mL Kan的SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，于30 ℃以250 r/min振蕩培養(yǎng)16～24 h，測(cè)定OD600 nm。同時(shí)，分別離心收集含pGBKT7-e18或pGBKT7的Y187菌體，再用5 mL SD/-Trp/Kan液體培養(yǎng)基重懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

上述酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化以及誘餌蛋白的細(xì)胞毒性和自激活活性檢測(cè)試驗(yàn)均參照Clontech MatchmakerTM文庫(kù)構(gòu)建和篩查試劑盒操作手冊(cè)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 e18誘餌載體的構(gòu)建

根據(jù)AcMNPV e18基因序列設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增e18編碼序列片段。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳圖中出現(xiàn)的是一條250 bp左右的單一條帶（圖1A），與預(yù)期大小相符。將此PCR片段插入pGBKT7構(gòu)成誘餌質(zhì)粒pGBDKT7-e18（圖1B）。其中，e18編碼序列被插在GAL4蛋白DNA結(jié)合域編碼序列（GAL4-BD）下游，位于同一閱讀框中，受ADH1啟動(dòng)子調(diào)控。位于GAL4-BD序列與e18序列之間的T7啟動(dòng)子序列用于在大腸桿菌中啟動(dòng)e18表達(dá)，在酵母細(xì)胞中無(wú)功能活性。pGBDKT7-e18經(jīng)EcoR I和Pst I雙酶切后在瓊脂糖凝膠電泳圖上呈現(xiàn)一條大于5 000 bp和另一略大于250 bp的條帶（圖1C），后者為預(yù)期的e18序列條帶。測(cè)序結(jié)果顯示在pGBDKT7-e18中e18序列及上、下游相鄰序列與設(shè)計(jì)預(yù)期一致。

2.2 BD-E18融合蛋白的細(xì)胞自激活檢測(cè)

將由誘餌載體pGBDKT7-e18轉(zhuǎn)化的酵母菌株Y187涂布在含X-gal的營(yíng)養(yǎng)缺陷型SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade固體培養(yǎng)基上，結(jié)果只在SD/-Trp培養(yǎng)基上可見(jiàn)菌落，而在SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade固體培養(yǎng)基上沒(méi)有菌落形成（圖2），表明報(bào)告基因ADE2、HIS3未被激活。在SD/-Trp培養(yǎng)基上形成的菌落全部為白色（圖2A），表明編碼α-半乳糖苷酶的報(bào)告基因MEL1也沒(méi)有激活。轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109產(chǎn)生同樣的現(xiàn)象。說(shuō)明pGBDKT7-e18對(duì)這兩個(gè)菌株均無(wú)轉(zhuǎn)錄自激活作用。

2.3 BD-E18融合蛋白的細(xì)胞毒性檢測(cè)

將由誘餌質(zhì)粒pGBDKT7-e18或空載體pGBDKT7轉(zhuǎn)化的酵母菌株Y187分別接種于50 mL液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)18 h，測(cè)得OD600 nm分別為1.22和1.10，均超過(guò)了0.8的判斷標(biāo)準(zhǔn)。離心收集菌體，并用5 mL液體培養(yǎng)基將菌體重懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。二者的密度都大于1×109個(gè)/mL。說(shuō)明該融合蛋白對(duì)酵母菌株Y187沒(méi)有毒性，可用于下一步的文庫(kù)篩選。

3 討論

酵母雙雜交技術(shù)是篩選與目標(biāo)蛋白相互作用的未知蛋白的高通量技術(shù)，在蛋白質(zhì)相互作用研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[8，9]。病毒在感染過(guò)程中與宿主細(xì)胞發(fā)生眾多的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。被膜蛋白E18是一種保守的桿狀病毒被膜蛋白，是少數(shù)幾種同時(shí)存在于ODV和BV兩種病毒體的被膜蛋白之一[3-5]。研究與E18相互作用的蛋白質(zhì)有助于闡明E18在病毒感染和復(fù)制周期中的作用。本研究構(gòu)建了AcMNPV e18基因誘餌載體，酵母的轉(zhuǎn)化、液體培養(yǎng)和營(yíng)養(yǎng)缺陷選擇培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，該誘餌質(zhì)粒表達(dá)的誘餌蛋白對(duì)酵母菌株無(wú)毒性，也沒(méi)有自激活作用，因此可以應(yīng)用于后續(xù)通過(guò)AcMNPV宿主昆蟲(chóng)或細(xì)胞cDNA文庫(kù)篩查與E18相互作用蛋白質(zhì)的工作。包含AcMNPV e18基因的誘餌質(zhì)粒無(wú)自激活作用，顯示E18不包含轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，可能不直接參與對(duì)宿主或病毒基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。

參考文獻(xiàn)：

[1] KING A M Q，LEFKOWITZ E，ADAMS M J，et al. Virus Taxonomy：Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses[M]. London，UK：Academic Press，2011. 67-68.

[2] ROHRMANN G F.Baculovirus molecular biology[EB/OL]. http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK49500/，2012-06-30.

[3] BRAUNAGEL S C，RUSSELL W K，ROSAS-ACOSTA G，et al. Determination of the protein composition of the occlusion-derived virus of Autographa californica nucleopolyhedrovirus[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（17）：9797-9802.

[4] WANG R，DENG F，HOU D，et al. Proteomics of the Autographa californica nucleopolyhedrovirus budded virions[J]. J Virol，2010，84（14）：7233-7242.

[5] BRAUNAGEL S C，HE H，RAMAMURTHY P，et al. Transcription，translation，and cellular localization of three Autographa californica nuclear polyhedrosis virus structural proteins：ODV-E18，ODV-E35，and ODV-EC27[J]. Virology，1996，222（1）：100-114.

[6] MCCARTHY C B，THEILMANN D A. AcMNPV ac143 （odv-e18） is essential for mediating budded virus production and is the 30th baculovirus core gene[J]. Virology，2008，375（1）：277-291.

[7] AYRES M D，HOWARD S C，KUZIO J，et al. The complete DNA sequence of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus[J]. Virology，1994，202（2）：586-605.

[8] FIELDS S，SONG O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions[J]. Nature，1989，340（6230）：245-246.

[9] FIELDS S. Interactive learning：lessons from two hybrids over two decades[J]. Proteomics，2009，9（23）：5209-5213.