粘質(zhì)沙雷氏菌α—乙酰乳酸脫羧酶基因的體外表達

摘要：根據(jù)GenBank中α-乙酰乳酸脫羧酶的基因序列（slaA）設計引物，以粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）HU1基因組DNA為模板通過PCR擴增得到了目標基因，全長為780 bp。將該基因分別連接到大腸桿菌表達載體pET30a和畢赤酵母表達載體pPICZαA上，構(gòu)建表達質(zhì)粒pET30a-slaA和pPICZαA-slaA，并在對應的宿主中進行了表達。結(jié)果表明，大腸桿菌和畢赤酵母的表達產(chǎn)物的最適溫度和pH均分別為40 ℃和7，兩者在不同pH下的穩(wěn)定性也相似，只不過畢赤酵母的表達產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性要略強于大腸桿菌的表達產(chǎn)物。

關鍵詞：粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）；α-乙酰乳酸脫羧酶；體外表達

中圖分類號：Q786 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）10-2431-04

在啤酒工業(yè)中，雙乙酰含量是衡量啤酒成熟與否的重要指標，該物質(zhì)主要由合成纈氨酸的中間產(chǎn)物α-乙酰乳酸在酵母細胞外經(jīng)非酶氧化脫羧而產(chǎn)生。由于過多的雙乙酰會帶來令人不愉快的餿飯味，工程技術人員會使用相關的手段和工藝降低啤酒中的雙乙酰濃度到一定范圍內(nèi)[1]。α-乙酰乳酸脫羧酶能夠降低啤酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的雙乙酰，縮短熟化期，改善啤酒口味，加速啤酒的成熟。但是啤酒酵母菌自身不能產(chǎn)生α-乙酰乳酸脫羧酶[2]，將α-乙酰乳酸脫羧酶基因整合到啤酒酵母染色體中表達是降低啤酒中雙乙酰濃度的措施之一[3-6]。外源表達的α-乙酰乳酸脫羧酶已經(jīng)作為一種成熟的酶制劑產(chǎn)品被直接應用于生產(chǎn)實踐中，可以有效地控制啤酒中的雙乙酰濃度。目前國內(nèi)市場上α-乙酰乳酸脫羧酶的品牌產(chǎn)品很多，國外代表有丹麥的諾維信公司（Novozymes）的產(chǎn)品，國內(nèi)代表有邢臺酶制劑廠、廣西大學、南寧富谷科技有限公司以及保定滿城金星化工有限公司的產(chǎn)品。本研究從粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）克隆到了α-乙酰乳酸脫羧酶基因，并在大腸桿菌和畢赤酵母中進行體外表達，結(jié)果表明該酶具有較為樂觀的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 粘質(zhì)沙雷氏菌HU1、大腸桿菌（Escherichia coli Top10、BL21）、畢赤酵母GS115、質(zhì)粒pET30a、pPICZαA由湖北大學湖北省工業(yè)生物技術重點實驗室保存。

1.1.2 酶與試劑 限制性內(nèi)切酶、DNA快速連接試劑盒、高保真PCR聚合酶Primestar等均購自TaKaRa公司，基因組抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒購自美國Omega生物技術公司，其他抗生素和化學試劑均為國產(chǎn)分析純或者進口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB、YPD、MD、BMGY、BMMY見畢赤酵母操作手冊。

1.2 方法

1.2.1 α-乙酰乳酸脫羧酶基因的擴增 根據(jù)α-乙酰乳酸脫羧酶基因（slaA）序列選擇適當?shù)拿盖形稽c設計引物。PCR反應循環(huán)條件為：95 ℃，5 min；95 ℃、30 s，52 ℃、30 s，72 ℃、60 s，30個循環(huán)；72 ℃，7 min。

1.2.2 序列測定與分析 將純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD18T載體上，構(gòu)建測序質(zhì)粒pMD18T-slaA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞，對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行雙酶切鑒定并送至上海英駿生物技術有限公司測序。

1.2.3 α-乙酰乳酸脫羧酶基因在大腸桿菌中的表達及產(chǎn)物鑒定 首先根據(jù)測序得到的α-乙酰乳酸脫羧酶基因序列，引入酶切位點Nco I/Hind III設計大腸桿菌表達載體引物。將用該引物擴增得到的PCR產(chǎn)物純化并雙酶切，與經(jīng)同樣的內(nèi)切酶處理后的載體pET30a連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞，挑取轉(zhuǎn)化子并鑒定。將鑒定得到的重組表達質(zhì)粒pET30a-slaA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，挑取平板上的單克隆接種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)液中振蕩過夜，然后按照體積比1∶50的接種量轉(zhuǎn)接至200 mL的LB培養(yǎng)液中，待培養(yǎng)液吸光度為0.5左右時，于30 ℃用IPTG誘導。用超聲波破菌，進行SDS-PAGE電泳[7]。

1.2.4 α-乙酰乳酸脫羧酶基因在畢赤酵母中的表達及產(chǎn)物鑒定 根據(jù)α-乙酰乳酸脫羧酶基因設計畢赤酵母表達載體引物，分別引入酶切位點EcoR I/Not I，以粘質(zhì)沙雷氏菌基因組DNA為模板進行PCR擴增。將純化的PCR產(chǎn)物和載體pPICZαA分別用EcoR I和Not I雙酶切，然后連接并且轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞，涂布于含25 mg/L Zeocin的低鹽LB培養(yǎng)基上。重組質(zhì)粒經(jīng)過PCR和酶切驗證后進行測序。將讀碼框正確的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化于畢赤酵母GS115中，轉(zhuǎn)化條件為1.5 kV、25 μF、200 Ω。將轉(zhuǎn)化細胞涂布在含有100 mg/L Zeocin的YPD平板上，于30 ℃培養(yǎng)2～3 d。隨機挑取轉(zhuǎn)化子接種于100 mL BMGY生長培養(yǎng)基中，于30 ℃以220 r/min培養(yǎng)2 d，以5 000 r/min離心10 min，收集菌體，將菌體轉(zhuǎn)移至50 mL BMMY誘導培養(yǎng)基中，用以上條件繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h補加甲醇至終濃度為5%。每12 h取樣，以5 000 r/min離心5 min，收集上清液，為粗酶液。

1.2.5 α-乙酰乳酸脫羧酶的活性分析 將大腸桿菌或者畢赤酵母的表達產(chǎn)物用鎳凝膠親和層析法純化后測定活性，測定方法如下：取150 μL一定濃度的待測樣品加入50 μmol/L的磷酸鉀緩沖液（pH 6.2），混勻加入50 μL的水解底物溶液，室溫放置10 min。立即加入250 μL 2.5 mol/L的NaOH溶液終止反應。在上述反應液中加入4.5 mL肌酸-萘酚溶液，于室溫顯色反應1 h，測定吸光度[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-乙酰乳酸脫羧酶基因的PCR擴增及其生物信息學分析

根據(jù)Serratia marcescens MG1和S. marcescens H30的α-乙酰乳酸脫羧酶基因序列[9]設計引物，以抽提的S. marcescens HU1總DNA為模板，用引物擴增α-乙酰乳酸脫羧酶基因，擴增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果與理論結(jié)果吻合。該片斷的測序結(jié)果表明該基因編碼區(qū)序列全長為780 bp，編碼260個氨基酸。通過PEPTOOL工具分析可知，該α-乙酰乳酸脫羧酶成熟蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為28.9 ku，等電點為5.38。BLAST比對結(jié)果表明該蛋白質(zhì)序列與Vibrio cholerae，Klebsiella terrigena和Bacillus subtilis中的α-乙酰乳酸脫羧酶同源性分別達到74%、74%和67%。

2.2 α-乙酰乳酸脫羧酶基因表達質(zhì)粒pET30a-slaA和pPICZαA-slaA的構(gòu)建

將擴增的α-乙酰乳酸脫羧酶基因克隆到pET30a載體上，構(gòu)成重組質(zhì)粒pET30a-slaA，進行雙酶切驗證。結(jié)果表明重組質(zhì)粒經(jīng)Nco I/Hind III雙酶切后產(chǎn)生與目的基因同樣大小的條帶和載體的條帶，表明α-乙酰乳酸脫羧酶基因已經(jīng)成功克隆到pET30a載體中。同樣將該基因克隆到pPICZαA上，結(jié)果表明，pPICZαA-slaA經(jīng)過EcoR I/Not I雙酶切后產(chǎn)生同α-乙酰乳酸脫羧酶基因同樣大小的產(chǎn)物以及載體片段，結(jié)果表明α-乙酰乳酸脫羧酶基因已成功克隆到pPICZαA載體中。重組質(zhì)粒送至上海英駿生物技術有限公司測序，結(jié)果表明讀碼框正確，可以進行下一步的表達試驗。

2.3 α-乙酰乳酸脫羧酶表達菌株的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pET30a-slaA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，在含卡那霉素的LB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子。將重組質(zhì)粒pPICZαA-slaA轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，在含100 mg/L Zeocin的YPD培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化子。酵母轉(zhuǎn)化子通過PCR驗證表明基因組中已經(jīng)整合了α-乙酰乳酸脫羧酶基因。配制含不同濃度Zeocin的YPD培養(yǎng)基，將篩選得到的轉(zhuǎn)化子用影印法依次接種到含250、500、1 000 mg/L Zeocin的平板上，于30 ℃下培養(yǎng)2～3 d，篩選能在高濃度Zeocin下生長的菌株。得到的菌株基因組中可能含有多個拷貝數(shù)的α-乙酰乳酸脫羧酶基因。

2.4 α-乙酰乳酸脫羧酶基因的表達與SDS-PAGE分析

含有重組質(zhì)粒pET30a-slaA的大腸桿菌BL21經(jīng)誘導表達后，收集細胞，用超聲波破碎后進行SDS-PAGE電泳。結(jié)果表明，重組菌和對照菌株（pET30a）相比較，在約29 ku處增加了一條蛋白質(zhì)條帶，與預測的基因表達產(chǎn)物一致（圖1A）。將在高濃度Zeocin平板上生長的GS115（pPICZαA-slaA）轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在BMMY培養(yǎng)基中，用甲醇誘導3 d，取樣離心，上清液進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明，重組畢赤酵母菌株的發(fā)酵上清液比對照菌株的發(fā)酵上清液多了一個29 ku的蛋白質(zhì)條帶，該條帶與目的基因表達產(chǎn)物一致（圖1B）。兩個試驗結(jié)果表明α-乙酰乳酸脫羧酶基因的大腸桿菌和畢赤酵母重組表達菌株均已成功構(gòu)建。

2.5 溫度對重組α-乙酰乳酸脫羧酶活的影響

用鎳柱將兩種宿主表達的酶純化后，分別在不同的溫度下測定大腸桿菌和畢赤酵母表達產(chǎn)物的酶活。由圖2A可知，大腸桿菌表達的α-乙酰乳酸脫羧酶的最適反應溫度為40 ℃，在50～60 ℃維持40%以上的酶活；由圖2B可知，畢赤酵母表達的α-乙酰乳酸脫羧酶的最適反應溫度為40 ℃，在50 ℃還有90%以上的酶活。

2.6 pH對重組α-乙酰乳酸脫羧酶活的影響

分別測定大腸桿菌和畢赤酵母表達的重組α-乙酰乳酸脫羧酶在不同pH下的酶活。由圖3A可知，大腸桿菌的表達產(chǎn)物的最適反應pH為7，在pH 6、8維持70%以上的酶活，在pH 9維持40%以上的酶活，而pH超過11就基本沒有酶活了。由圖3B可知，畢赤酵母的表達產(chǎn)物的最適反應pH為7，在pH 6、8可以維持60%左右的酶活，在pH 9～10可以維持30%以上的酶活。

2.7 重組α-乙酰乳酸脫羧酶的溫度穩(wěn)定性試驗結(jié)果

將純化后的兩種來源的α-乙酰乳酸脫羧酶在不同溫度下分別水浴處理0、5、10、15、20、25、30 min，之后測定酶活，以未處理的作為對照，得到α-乙酰乳酸脫羧酶的相對酶活穩(wěn)定性曲線。由圖4A可知，大腸桿菌的表達產(chǎn)物在30 ℃較為穩(wěn)定，處理30 min時還保持有80%左右的相對酶活；40 ℃時相對酶活就變的十分不穩(wěn)定，處理30 min后相對酶活只剩10%。而圖4B則表明畢赤酵母的表達產(chǎn)物在30 ℃和40 ℃都較為穩(wěn)定，處理30 min時還保持有70%左右的相對酶活；50 ℃時相對酶活開始變的十分不穩(wěn)定，處理30 min時相對酶活只剩20%。

2.8 重組α-乙酰乳酸脫羧酶的pH穩(wěn)定性試驗結(jié)果

酶經(jīng)不同pH的緩沖液處理，于4 ℃過夜，測定相對酶活，得到pH穩(wěn)定性曲線。由圖5可知，大腸桿菌表達的重組α-乙酰乳酸脫羧酶相對酶活在pH 5～8的范圍內(nèi)能保持50%以上，而在pH 6～7之間比較穩(wěn)定，相對酶活保持在80%以上。與之對應的是，畢赤酵母表達產(chǎn)物的pH穩(wěn)定性與大腸桿菌的表達產(chǎn)物相似。

3 小結(jié)與討論

α-乙酰乳酸脫羧酶已經(jīng)被廣泛地用在啤酒工業(yè)中，為此克隆和研究不同來源和性質(zhì)的α-乙酰乳酸脫羧酶基因具有極大的工業(yè)應用價值和經(jīng)濟價值。本研究首次將粘質(zhì)沙雷氏菌中的α-乙酰乳酸脫羧酶基因在大腸桿菌和畢赤酵母兩種宿主中進行了表達，并且研究了其相關酶學性質(zhì)，結(jié)果表明大腸桿菌和畢赤酵母的表達產(chǎn)物的最適溫度和pH均分別為40 ℃和7，兩者在不同pH下的穩(wěn)定性也相似，只不過畢赤酵母的表達產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性要略強于大腸桿菌的表達產(chǎn)物。這些結(jié)論表明大腸桿菌和畢赤酵母表達產(chǎn)物性質(zhì)并沒有很大的區(qū)別，這個可能與α-乙酰乳酸脫羧酶基因上沒有糖基化位點和其他修飾位點存在有關，因而兩種宿主對于該基因的翻譯和修飾相近。但是考慮到畢赤酵母能夠?qū)⑼庠吹鞍追置诘桨?，降低了其后續(xù)生產(chǎn)和純化的難度，節(jié)約了成本，從而具有更廣闊的前景。研究為將粘質(zhì)沙雷氏菌中的α-乙酰乳酸脫羧酶應用于啤酒工業(yè)打下了基礎。

參考文獻：

[1] 秦玉靜，高 東，劉巍峰.啤酒生產(chǎn)中雙乙酰形成的分子遺傳學及其控制[J].工業(yè)微生物，1999，29（2）：38-43.

[2] 陳 煒，何秉旺. α-乙酰乳酸脫羧酶的研究進展[J].微生物學通報，1993，20（5）：307-310.

[3] GODTFREDSEN S E，LORCK K，SIGSGAARD R.On the occurrence of α-acetolactate decarboxylase among microoganisms [J]. Carlsberg Res Commun，1983，48（3）：239-247.

[4] SUIHKO M L， BLOMQVIST K，PENTTILA M，et al. Recombinant brewer’s yeast strains suitable for accelerated brewing[J].J Biotechnol，1990，14（3-4）：285-300.

[5] YAMANO S， KONDO K， TANAKA J，et al. Construction of a brewer’s yeast having α-acetolactate decarboxylase gene from Acetobacter aceti ssp. xylinum integrated in the genome[J].Journal of Biotechnology，1994，32（2）：173-178.

[6] 尹 東，盧大寧，黃百渠，等.重組α-乙酰乳酸脫羧酶的表達及部分酶學特性[J].生物化學與生物物理學報，1998，30（4）：325-329.

[7] LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature，1970，227（5259）：680-685.

[8] AUSUBEL F M，BRENT R，KINGSTON R E，et al. Short Protocols in Molecular Biology[M].3rd edition. New York：John Wiley Sons Inc，1997.

[9] RAO B，ZHANG L Y，SHEN Y，et al.Characterization and regulation of the 2，3-butanediol pathway in Serratia marcescens[J]. Appl Microbiol Biotechnol，2012，93（5）：2147-2159.