一株類胡蘿卜素高產(chǎn)菌的篩選與鑒定

摘要：以自然環(huán)境中松樹林土壤、下水道淤泥、飯店周圍油膩土壤、農(nóng)田土壤、落花、十字花科蔬菜、辣椒以及實(shí)驗(yàn)室空氣為類胡蘿卜素產(chǎn)生菌的初分離材料，采用酸-熱破壁法用丙酮提取類胡蘿卜素，根據(jù)單位體積發(fā)酵液類胡蘿卜素產(chǎn)量確定了一株高產(chǎn)光合細(xì)菌（BSⅡ6）。進(jìn)一步對(duì)其形態(tài)、生理生化特征、類胡蘿卜素產(chǎn)量、分子生物學(xué)特征進(jìn)行了初步研究，初步鑒定菌株BSⅡ6為無色桿菌屬的一個(gè)種Achromobacter sp.，BSⅡ6所產(chǎn)色素主要成分為番茄紅素，類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到了7.46 μg/mL。

關(guān)鍵詞：類胡蘿卜素；菌種；篩選；鑒定；發(fā)酵；無色桿菌屬（Achromobacter）

中圖分類號(hào)：Q93-331 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）10-2389-04

類胡蘿卜素（Carotenoids）是自然界中廣泛存在的色素，是萜烯基團(tuán)類的不飽和化合物，結(jié)構(gòu)中有許多共軛雙鍵。由于它是維生素A前體，同時(shí)又具有抗氧化、預(yù)防和抑制腫瘤、增加宿主免疫力等功能，已被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、化妝品、醫(yī)藥工業(yè)。目前，主要是通過化學(xué)合成法、植物提取法獲得類胡蘿卜素，少數(shù)是由微生物發(fā)酵生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成色素由于毒性問題而受到限制，從植物中提取類胡蘿卜素難以大量生產(chǎn)，且成本較高。因此，利用微生物發(fā)酵獲取類胡蘿卜素是較好的方式。目前，國(guó)內(nèi)外利用微生物合成類胡蘿卜素的研究主要集中在三孢布拉霉菌和紅酵母方面。其中，三孢布拉霉菌菌株生長(zhǎng)迅速、生物量高，是國(guó)際上采用的實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良菌株。前蘇聯(lián)和東歐地區(qū)已達(dá)小規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)水平，但技術(shù)工藝較為復(fù)雜。在我國(guó)，該方法正處于研究階段。自21世紀(jì)90年代初以來，我國(guó)對(duì)此方法進(jìn)行了大量研究，但發(fā)酵過程中存在一系列復(fù)雜的技術(shù)性問題，如發(fā)酵液黏稠度高、溶解氧利用難等，從而距大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)還有相當(dāng)?shù)囊欢尉嚯x。利用光合細(xì)菌生產(chǎn)類胡蘿卜素，雖然目前色素發(fā)酵水平比三孢布拉霉菌低，但也具有一定的優(yōu)點(diǎn)：可以利用蔗糖、廢糖蜜等進(jìn)行培養(yǎng)，成本較低廉；周期短，發(fā)酵控制容易，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，無論是從品質(zhì)技術(shù)、資源還是成本等因素考慮，研究光合細(xì)菌生產(chǎn)類胡蘿卜素都具有一定的應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)前景。本研究從各種自然環(huán)境中分離篩選產(chǎn)類胡蘿卜素菌株，根據(jù)單位體積發(fā)酵液類胡蘿卜素產(chǎn)量確定了一株高產(chǎn)光合細(xì)菌（BSⅡ6），并對(duì)其形態(tài)、生理生化特征、類胡蘿卜素產(chǎn)量、分子生物學(xué)特征進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 土樣：采集了農(nóng)田土壤、下水道淤泥、松樹林土壤、飯店周圍油膩土壤4種土樣。落花：收集了櫻花、油菜花、白菜花、迎春花、蘿卜花、豌豆花、鳶尾花、不知名野花8種植物的花。蔬菜：十字花科蔬菜、辣椒等采集于貴陽市花溪區(qū)農(nóng)家菜園。還有實(shí)驗(yàn)室空氣。

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方為牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂15～20 g/L，pH 7.0～7.2，于121 ℃滅菌30 min。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15～20 g/L，pH 自然；配制方法為馬鈴薯去皮切成塊煮沸30 min，然后用紗布過濾，再加葡萄糖及瓊脂，溶化后補(bǔ)足水至1 000 mL，于121 ℃滅菌30 min。種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖5 g/L，牛肉膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，于115 ℃滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基[2]配方為葡萄糖40 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，Na2HPO4 1 g/L，KH2HPO4 1 g/L，pH 6.0（真菌）、7.2～7.4（細(xì)菌），于121 ℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離篩選

1）土樣菌株的分離。采用稀釋平板法。先用研缽將混勻的土樣磨碎，稱取新鮮土壤10 g，放入盛有100 mL無菌水的250 mL三角瓶?jī)?nèi)（三角瓶?jī)?nèi)有玻璃珠），然后放在搖床上以70 r/min振蕩10 min，靜置片刻，取10-4、10-5、10-6 3個(gè)稀釋度，涂布于牛肉膏蛋白胨平板上培養(yǎng)48 h，挑出呈黃色、紅色、橙黃色的菌落進(jìn)一步純化，獲得純培養(yǎng)，并接種于斜面培養(yǎng)基保存。

2）落花菌株的分離。將落花用水沖干凈，用70%乙醇浸泡5 min，在牛肉膏蛋白胨平板上涂抹接種，后續(xù)操作與土樣菌株的分離相同。

3）蔬菜內(nèi)生菌的分離。①內(nèi)生細(xì)菌的分離：將植株用水沖洗干凈，然后隨機(jī)稱取根、莖、葉各器官0.5 g，用70%乙醇浸泡5 min，再用1 g/L HgCl2表面消毒5～10 min（葉片5 min，根、莖10 min），用無菌水沖洗3次，樣品晾干后轉(zhuǎn)入無菌研缽中研磨勻漿。加10 mL無菌水碾碎，靜置15 min后，配置成10-2、10-3、10-4 3個(gè)稀釋度，各取100 μL涂牛肉膏蛋白胨平板，各處理重復(fù)3次，于32 ℃黑暗培養(yǎng)48～72 h，后續(xù)操作與土樣菌株的分離相同。②內(nèi)生真菌的分離：采用組織塊法分離內(nèi)生真菌。將植株不同器官的樣品用去離子水沖洗干凈，浸泡于75%乙醇2～5 min進(jìn)行表面消毒，再將樣品放入1 g/L HgCl2溶液中進(jìn)一步消毒10～30 s，最后用無菌水沖洗3次。在無菌條件下將樣品切成小片，其中葉片切成1 cm×1 cm的小塊，根、莖與枝取韌皮部切成0.5 cm×0.5 cm左右的小段，再移入加有鏈霉素和青霉素的PDA平板中，于28 ℃避光培養(yǎng)3～7 d，待長(zhǎng)出菌體，后續(xù)操作與土樣菌株的分離相同。

4）培養(yǎng)條件。斜面培養(yǎng)：細(xì)菌接種牛肉膏蛋白胨斜面，于32 ℃培養(yǎng)24～48 h。真菌接種PDA斜面，于28 ℃培養(yǎng)48～120 h。搖瓶培養(yǎng)：將斜面培養(yǎng)的菌體制備成菌懸液，接種于細(xì)菌和真菌發(fā)酵培養(yǎng)基，真菌于28 ℃以150 r/min培養(yǎng)120 h；細(xì)菌于32 ℃以150 r/min培養(yǎng)120 h。

1.2.2 細(xì)胞破碎方法 酸-熱破壁法：取搖瓶培養(yǎng)的菌液5 mL加入潔凈離心管中，以4 000 r/min離心15 min，棄上清液，加入3 mol/L HCl 5 mL，于室溫振蕩浸泡30 min，沸水浴加熱4 min，冰水浴冷卻，以4 000 r/min離心15 min，棄上清，細(xì)胞泥用去離子水洗滌2次后加入5 mL丙酮，于室溫振蕩30 min，離心所得上清即類胡蘿卜素提取液。

1.2.3 篩選方法 初篩方法采用顯色反應(yīng)法[3]。加等體積石油醚于類胡蘿卜素丙酮浸提液，振蕩，靜置分層，取上層醚層加入等體積的含100 g/L KOH的甲醇溶液，充分振蕩，加入少許50 g/L NaCl溶液。取上層黃紅色醚層，分別傾入裝有2 mL濃H2SO4、濃HCl的試管中，觀察顏色變化。

復(fù)篩方法采用三指特征吸收峰法。將從發(fā)酵液經(jīng)離心、破壁、有機(jī)溶劑浸提后的色素在TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)上進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

1.2.4 類胡蘿卜素的測(cè)定 取干菌體1 g，或5 mL發(fā)酵液以4 000 r/min離心、水洗兩次得到的濕菌體，加5 mL 3 mol/L HCl振蕩30 min；沸水浴4 min，速冷，以4 000 r/min離心15 min，去HCl，用去離子水洗兩次，去上清液，加5 mL丙酮，振蕩30 min；以4 000 r/min離心15 min，取色素上清液，用丙酮作對(duì)照，用722分光光度計(jì)在474 nm處測(cè)吸光度[5]。色素含量（μg/g）=A474 nm×V×D/（0.16×W）；色素產(chǎn)量（μg/mL）=A474 nm×V×D/（0.16×L）。式中，A474 nm表示最大吸光度；V表示提取色素所用溶劑量（mL）；D表示測(cè)樣時(shí)所稀釋的倍數(shù)；0.16是類胡蘿卜素消光系數(shù)；W表示菌體干重（g）；L表示發(fā)酵液體積（mL）。

1.2.5 菌種的鑒定 形態(tài)與生理生化鑒定：根據(jù)菌株生長(zhǎng)的形狀、顏色、大小、透明度以及生理生化特征查閱《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）[6]。分子生物學(xué)鑒定：利用16 S rDNA序列對(duì)細(xì)菌菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。細(xì)菌基因組DNA的提取按照試劑盒MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0的操作步驟。引物F：5′-GAGAGTTTGATCC

TGGCTCAG-3′，R：5′-GCCCCCGTCAATTCCTTTGA

G-3′；以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL：ddH2O 19 μL，2×PCR Master Mix 25 μL，混和引物2 μL，DNA模板4 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃，5 min；94 ℃、50 s ，54 ℃、40 s，72 ℃、40 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃，8 min。采用標(biāo)記終止物法進(jìn)行序列測(cè)定。運(yùn)用Blastn 2.2.2程序搜索核酸數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩結(jié)果

從土壤、落花、各種蔬菜以及實(shí)驗(yàn)室空氣中分離到呈紅色、黃色、橙紅色的菌株共505株。分別將這些菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，提取菌體色素，然后采用濃H2SO4、濃HCl顯色反應(yīng)初篩到能產(chǎn)類胡蘿卜素的菌株25株，其中真菌18株、細(xì)菌7株。25株菌株所產(chǎn)色素呈現(xiàn)出紅色、黃色、淺黃色和橙紅色（表1）。

2.2 復(fù)篩結(jié)果

由于類胡蘿卜素分子多為萜類物質(zhì)，它們是由多個(gè)異戊單體聚合而成，所以在波長(zhǎng)300～600 nm處有典型的三指特征吸收峰。將初篩得到的25株菌株發(fā)酵菌體的色素粗提液進(jìn)行波譜掃描，結(jié)果均有三指特征吸收峰（波譜掃描圖略），各菌株最大吸收峰波長(zhǎng)及兩側(cè)肩峰波長(zhǎng)不完全相同，表明篩選到的菌株所合成的類胡蘿卜素種類不同。其中1株分離自下水道的細(xì)菌菌株BSⅡ6的類胡蘿卜素產(chǎn)量顯著高于其他菌株，達(dá)到了7.46 μg/mL（表1）。其300～550 nm波長(zhǎng)掃描光譜分析的最大吸收峰為474 nm，在其兩側(cè)455 nm和501 nm波長(zhǎng)有兩個(gè)明顯的肩峰（圖1），這是類胡蘿卜素具有的特征性吸收曲線[7]。參照文獻(xiàn)[8]分析最大吸收波長(zhǎng)可知，BSⅡ6所產(chǎn)類胡蘿卜素的主要成分可能是番茄紅素。

2.3 菌株BSⅡ6的鑒定結(jié)果

2.3.1 形態(tài)特征 由圖2可知，菌株BSⅡ6在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落圓形、橙紅色、不透明、表面平滑無皺褶、邊緣整齊。在肉湯培養(yǎng)基內(nèi)不形成菌膜，細(xì)胞呈絮狀沉淀聚集在試管底部。由圖3可知，菌株BSⅡ6為革蘭氏染色陰性，菌體呈短桿狀，端圓，無芽孢，細(xì)胞長(zhǎng)度為1.8～2.3 μm，寬度為0.3～0.4 μm。

2.3.2 菌株BSⅡ6的生理生化特征 菌株BSⅡ6的生理生化特征見表2，結(jié)合形態(tài)特征，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）初步鑒定菌株BSⅡ6為無色桿菌屬。

2.3.3 菌株BSⅡ6的分子生物學(xué)鑒定 從菌株BSⅡ6基因組擴(kuò)增獲971 bp的16 S rDNA序列片段，經(jīng)BLAST核酸數(shù)據(jù)庫(kù)搜索、分析發(fā)現(xiàn)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的序列相似性最高的是菌株Achromobacter xylosoxidans A8（木糖氧化無色桿菌）16 S rDNA序列，其相似性為92%，相似性片段長(zhǎng)度為893 bp。結(jié)合形態(tài)與生理生化特征，將菌株BSⅡ6鑒定為無色桿菌屬的一個(gè)種Achromobacter sp.。

3 小結(jié)與討論

從土樣、落花、蔬菜還有實(shí)驗(yàn)室空氣中共分離篩選出了能產(chǎn)類胡蘿卜素的18株真菌、7株細(xì)菌。其中一大部分菌株都是從蘿卜類、白菜類、甘藍(lán)類十字花科植物中分離獲得，說明十字花科植物是分離產(chǎn)類胡蘿卜素微生物的良好資源。

分離的BSⅡ6菌株的類胡蘿卜素產(chǎn)量最高，達(dá)到了7.46 μg/mL，所產(chǎn)色素主要成分為番茄紅素。BSⅡ6菌株經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化以及分子生物學(xué)方法聯(lián)合鑒定為無色桿菌屬的一個(gè)種Achromobacter sp.。

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