枇杷葉總黃酮的超聲波輔助提取及其抑菌效果研究

摘要：以枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）葉為原料，采用超聲波輔助法提取枇杷葉中總黃酮，并對其抑菌效果進行測定。結果表明最佳提取工藝條件為：料液比1∶15（g∶mL），提取溫度50 ℃，提取時間30 min，此條件下的總黃酮提取率為56.30 mg/g；總黃酮提取物對大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）有較強的抑制作用，對黃曲霉（Aspergilus flaus）和啤酒酵母（Saccharomyes cerevisiue）的抑制作用較差。

關鍵詞：枇杷葉；總黃酮；提??；抑菌

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）10-2383-03

枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）為薔薇科（Rosaceae）枇杷屬（Eriobotrya）植物，起源于中國，迄今已分布到全世界的30多個國家[1]。枇杷的功效也越來越多地被研究，而枇杷葉的作用也越來越受到關注。枇杷葉是一味常用中藥，其味苦、微辛，性微寒，具有清肺止咳、降逆止嘔作用[2]。近年來，國內外對枇杷葉的化學成分和藥理作用研究較多，結果顯示已經分離得到的化學成分有三萜酸、黃酮類、多酚、倍半萜及其苷類。黃酮類化合物苷元主要為山奈酚、槲皮素，糖苷由1～3單糖組成。此外，還發(fā)現有乙?；S酮苷存在[3]。研究表明，生物總黃酮在身體中扮演著重要的角色，能降低血管脆性及異常的通透性，可以用來降低血脂和膽固醇，還具有止咳化痰功效[4]。同時可幫助人體對抗病毒、致癌物、毒素與過敏物質，同時具有一定的抑菌殺菌功效[5，6]。

本試驗以淮陰工學院內的枇杷樹葉為原材料，采用超聲波輔助法提取總黃酮，再利用提取的黃酮類化合物來研究抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

新鮮枇杷葉（采自淮陰工學院校園）：洗凈、烘干、粉碎40目待用。

供試菌種：大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、黃曲霉（Aspergilus flaus）、啤酒酵母（Saccharomyes cerevisiue）（均由淮陰工學院生化學院微生物實驗室提供）。

培養(yǎng)基：細菌用培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；霉菌、酵母菌用培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。

1.2 試劑與儀器

試劑：無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、蘆丁標準品。

試驗儀器：紫外-可見分光光度計、生化培養(yǎng)箱、滅菌鍋、數顯恒溫水浴鍋、電子天平、超聲波提取器等。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁分光光度法制作蘆丁標準曲線。

1.3.2 待測樣品制備 準確稱量2 g烘干粉碎為60目的枇杷葉，加入一定的提取劑，經超聲波輔助有機溶劑提取一定時間后，離心過濾，定容到50 mL，制成待測樣。

1.3.3 單因素試驗 ①超聲波功率對枇杷葉總黃酮提取率的影響。在反應溫度為50 ℃，反應時間為60 min，料液比1∶10（g/mL）條件下，在510 nm下測定吸光度值，計算提取率，考察不同超聲波功率對枇杷葉中總黃酮提取率的影響。②料液比對枇杷葉總黃酮提取率的影響。在反應溫度為50 ℃，提取時間為60 min，超聲功率為150 W，在510 nm下測定吸光度值，計算提取率，考察不同料液比對枇杷葉中總黃酮提取率的影響。③提取溫度對枇杷葉總黃酮提取率的影響。在反應時間為60 min，超聲功率為150 W，料液比為1∶10（g∶mL），在510 nm下測定吸光度值，計算提取率，考察不同提取溫度對枇杷葉中總黃酮提取率的影響。④提取時間對枇杷葉總黃酮提取率的影響。在反應溫度為50 ℃，料液比1∶10（g∶mL）條件下，超聲功率為150 W，在510 nm下測定吸光度值，計算提取率，考察不同提取時間對枇杷葉中總黃酮提取率的影響。

1.3.4 正交試驗 為確定超聲波輔助提取枇杷葉總黃酮的最優(yōu)工藝，在單因素試驗的基礎上，選用L9（33）正交表進行正交試驗，考察料液比（A）、溫度（B）、提取時間（C）的交互作用對枇杷葉中總黃酮提取率的影響，因素與水平見表1。

1.3.4 總黃酮的抑菌效果測定 菌懸液的制備：將相應的菌種接到斜面培養(yǎng)基上，細菌在（37±1） ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，霉菌和酵母菌于（28±1） ℃下恒溫培養(yǎng)48 h，連續(xù)培養(yǎng)3次，以無菌生理鹽水配制成孢子或菌體懸浮液，濃度為106～107 CFU/mL，備用。

抑菌作用的測定：采用濾紙片法，以無菌生理鹽水和0.5%山梨酸鉀水溶液作為對照。將直徑為6 mm的濾紙片160 ℃干熱滅菌后置于0.5%的提取液中浸泡24 h，并用無菌水和0.5%山梨酸鉀水溶液作為對照，進行相同處理。將制備好的菌懸液0.2 mL滴入到已倒有相應培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，涂布均勻，用無菌鑷子將濾紙片放入含菌平皿中，每皿4片，每種菌做3個重復，分別放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，測量各供試菌的抑菌圈直徑，取平均值。

判定是否抑菌的標準：以抑菌圈直徑大于6 mm者評價為有抑菌作用，無菌水對照組應無抑菌圈產生，否則試驗無效。無菌水對照組所測直徑為濾紙片直徑。

2 結果與分析

2.1 總黃酮的標準曲線

測得總黃酮標準曲線的回歸方程為：y=1.114 7x-0.001 9，R2=0.998 4。利用回歸方程計算出總黃酮含量。

2.1 不同因素對枇杷葉總黃酮提取率的影響

2.1.1 超聲波功率對枇杷葉總黃酮提取率的影響 由圖1可知，隨著提取功率的增加，提取率隨之升高，這是由于低的功率不能將細胞結構更好地破壞，有機溶劑無法將黃酮類化合物充分提取出來，功率越高提取率越高，因此功率在150 W時提取率最高。在隨后的單因素試驗中，以提取功率為進行。

2.1.2 料液比對枇杷葉總黃酮提取率的影響 由圖2可知，料液比從1∶5到1∶15，枇杷葉中總黃酮的提取率逐漸升高，而料液比在1∶15～1∶20時枇杷葉中總黃酮的提取率變化幅度較小，提取率在料液比為1∶15時最高。后續(xù)采用此料液比進行試驗。繼續(xù)增加溶劑的用量，提取率反而沒有提高。原因在于一定料液比已經將黃酮類化合物基本溶出，再增大料液比，黃酮類化合物的溶出量變化不大。

2.1.3 提取溫度對枇杷葉總黃酮提取率的影響 由圖3可知，超聲波提取時的溫度在20～50 ℃時，枇杷葉中總黃酮的提取率不斷升高，超過50 ℃逐漸降低，由此判斷，溫度升高，分子運動速度加快，黃酮類化合物更容易從細胞中轉移到溶質中，但是溫度過高，一些黃酮類化合物被破壞，同時溫度過高容易造成溶劑揮發(fā)損失，影響提取效果。

2.1.4 提取時間對枇杷葉總黃酮提取率的影響 由圖4可知，提取時間在30～60 min時枇杷葉中總黃酮的提取率不斷升高，在60～180 min時枇杷葉的提取率不斷下降，在60 min時達最高點，初步判斷提取時間為60 min時的提取率是最高的。后面采用此超聲時間進行試驗。

隨著提取時間的延長，總黃酮的提取率先升高后下降；超過60 min后，隨著時間的延長，其提取率反而下降，原因是時間過長，一些熱敏感組分會被破壞，此外溶劑揮發(fā)導致乙醇體積分數降低，從而使提取率下降。

2.2 正交試驗結果

正交試驗結果見表2，由表2的極差分析可知，在超聲波功率為150 W的情況下，料液比、提取溫度、提取時間三因素對黃酮提取率影響的主次順序為：A﹥B﹥C，即料液比﹥提取溫度﹥提取時間。枇杷葉中總黃酮提取的最佳提工藝條件為：A2B2C2，即提取溫度50 ℃，料液比1∶15，提取時間60 min。

2.3 枇杷葉總黃酮對微生物抑制效果的影響

把總黃酮提取液進行濃縮，經感觀鑒定，為黃褐色的黏稠狀，根據標準曲線計算其濃度。然后利用60%乙醇稀釋成若干濃度，涂在直徑6 mm的濾紙片上，待乙醇揮發(fā)后，置于相應菌種的培養(yǎng)基上，進行抑菌測定。

由表3可知，枇杷葉總黃酮提取物對大腸桿菌及枯草芽孢桿菌的抑菌效果較好，對黃曲霉的抑制作用較差，對啤酒酵母的抑制效果差。

3 結論

枇杷葉中總黃酮提取過程中，影響提取率的各因素的主次關系依次為A﹥B﹥C，即料液比﹥提取溫度﹥提取時間。最佳提取條件為：提取溫度50 ℃，料液比1∶15，提取時間60 min。最高提取率可達到56.30 mg/g。

枇杷葉中總黃酮對細菌有較強的抑制作用，對黃曲霉和啤酒酵母的抑制作用較差。枇杷葉總黃酮可以抑制因細菌引起的食物中毒。

參考文獻：

[1] 胡又厘，林順權.世界枇杷研究與生產[J].世界農業(yè)，2002（1）：18-20.

[2] 鞠建華，周 亮，林 耕，等.枇杷葉中三萜酸類成分及其抗炎、鎮(zhèn)咳活性研究[J].中國藥學雜志，2003，38（10）：752-757.

[3] 林玉霖，林文津，林力強.枇杷葉的研究現狀與開發(fā)前景[J].中國藥業(yè)，2006，29（10）：1111-1114.

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[6] 白鳳梅，蔡同一.類黃酮的生物活性及其機理的研究進展[J].食品科學，1999（8）：11-13.