大葉胡頹子莖抗菌活性部位研究

摘要：大葉胡頹子（Elaeagnus macrophylla Thunb）莖經(jīng)乙醇提取、系統(tǒng)溶劑萃取分離得到5個(gè)部位。用濾紙片法檢測(cè)各部位對(duì)5種常見呼吸道致病菌的抗菌活性，著重研究乙酸乙酯部位和正丁醇部位的抗菌作用。結(jié)果表明， 大葉胡頹子莖正丁醇部位和乙酸乙酯部位對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）和鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumanii）均有較強(qiáng)的體外抑制作用，兩個(gè)部位對(duì)不同菌種的抑菌效果有差異，正丁醇部位的綜合抑菌效果好于乙酸乙酯部位。大葉胡頹子莖乙酸乙酯部位和正丁醇部位對(duì)常見的5種呼吸道致病菌有較強(qiáng)的體外抗菌作用，說明其含有抗菌成分，可以用于研制治療呼吸道疾病的抗菌消炎新藥物。

關(guān)鍵詞：大葉胡頹子莖；溶劑萃取；乙酸乙酯部位；正丁醇部位；抑菌作用

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）10-2315-03

大葉胡頹子（Elaeagnus macrophylla Thunb）又名圓葉胡頹子、冬棗、海棗，屬胡頹子科（Elaeagnaceae）胡頹子屬（Elaeagnus）植物，為高2～3 m的常綠灌木，葉片正面翠綠，背面為銀白色，果實(shí)紅色可食。在中國(guó)主要分布于山東、浙江、江蘇的沿海島嶼和臺(tái)灣，在日本、韓國(guó)等國(guó)家也有分布。它根系發(fā)達(dá)，耐鹽堿，耐干旱、瘠薄，抗海風(fēng)、海霧，是沿海防風(fēng)和海濱綠化的良好樹種。大葉胡頹子根、葉、果皆可入藥，民間多用于平喘、止咳，也用來治吐血不止[1]。將大葉胡頹子作為藥材栽培，并以其果實(shí)代替丹皮，可用以治療婦科疾病[2，3]，近年的研究發(fā)現(xiàn)大葉胡頹子莖、葉對(duì)常見的呼吸道致病菌具有抗菌活性[4，5]，在藥品開發(fā)方面展現(xiàn)出利用前景。胡頹子科植物有3屬80余種，許多是具有很高生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物[6]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)該科植物的研究方向主要是成分分析、食用、藥用、環(huán)境保護(hù)，國(guó)外研究還涉及能源資源、共生根瘤菌和分子生物學(xué)方面[7-9]。試驗(yàn)考察大葉胡頹子莖不同部位對(duì)5種呼吸道病菌的抗菌活性，為進(jìn)一步追蹤其化學(xué)成分提供依據(jù)和導(dǎo)向，為海濱鹽生植物大葉胡頹子的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物與菌種 大葉胡頹子莖，采于山東威海榮城的雞鳴島。金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）和鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumanii）由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院實(shí)驗(yàn)室與中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所提供。

1.1.2 試劑與儀器 95%乙醇、70%乙醇、石油醚（沸程30～60 ℃），市售；氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、氯化鈉均為市售分析純；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉均為市售生化試劑；純凈水為實(shí)驗(yàn)室自制。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于細(xì)菌培養(yǎng)）：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂粉15～20 g、蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4。QE-200 g型粉碎機(jī)（武義縣屹立工具有限公司）；FA1104N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（嘉興市中新醫(yī)療儀器設(shè)備有限公司）；PS-5000型超聲波清洗機(jī)、CN61M/H-1650型臺(tái)式高速離心機(jī)（北京中西泰安技術(shù)服務(wù)有限公司）；AB204型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；減壓抽濾裝置、LRH-250-A型智能生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；SW-CJ型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大葉胡頹子莖不同部位的制備 大葉胡頹子莖38 ℃烘干后用粉碎機(jī)打成粉末，用95%的乙醇回流提取3 h，倒出上清液，濾渣再用95%乙醇回流提取3 h，按上述方法再用70%的乙醇回流提取2次，合并4次的濾液用高速離心機(jī)3 000 r/min離心15 min，抽濾上清液減壓濃縮至無醇味，加純凈水使其完全溶解，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取液及水相減壓濃縮成浸膏。

1.2.2 菌懸液的制備 用接種環(huán)挑取已活化的細(xì)菌置于無菌生理鹽水試管中，充分混合，為初始菌懸液；配制系列濃度的菌懸液，并做好標(biāo)記。用平板計(jì)數(shù)法確定各菌懸液細(xì)菌濃度，取濃度為1.0×105～1.0×106 CFU/mL的菌懸液為試驗(yàn)液。

1.2.3 抑菌試驗(yàn) 采用濾紙片法[10]。將各溶劑萃取物的浸膏分別用純凈水配制成30 mg/mL藥液，經(jīng)0.22 μm濾菌膜過濾。在超凈工作臺(tái)內(nèi)將滅菌濾紙片用無菌鑷子攤布于裝有藥液的滅菌培養(yǎng)皿中吸收藥液，浸泡15 min，不斷翻動(dòng)，使濾紙片吸足藥液。取出含藥液濾紙片自然瀝干后放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)保存。將滅菌后的培養(yǎng)基傾入無菌培養(yǎng)皿中，待其凝固后移取0.1 mL菌懸液于培養(yǎng)皿中，用無菌涂布棒將菌懸液均勻涂布，制成含菌平板，以涂布純凈水的平板作對(duì)照。用無菌鑷子將含藥液濾紙片均勻間隔貼于平板上，每皿放4片，以純凈水作為對(duì)照。放入37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值并作方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 大葉胡頹子莖乙酸乙酯部位對(duì)供試菌的抑菌效果

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氯仿部位和水部位均未表現(xiàn)出抑菌效果，石油醚部位的得率很小且抑菌效果很弱，后續(xù)不作重點(diǎn)研究。中等極性的乙酸乙酯部位和較強(qiáng)極性的正丁醇部位表現(xiàn)出明顯的抑菌作用，是大葉胡頹子莖的抗菌活性部位，將其作為研究對(duì)象。

大葉胡頹子莖乙酸乙酯部位對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克氏桿菌和大腸桿菌都具有抑菌作用，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（表1）和多重比較（表2）可知，大葉胡頹子莖乙酸乙酯部位對(duì)5種供試菌抑菌作用存在極顯著性差異。大葉胡頹子莖乙酸乙酯部位對(duì)金黃色葡萄球菌和鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制作用與對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑制作用有極顯著差異，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制作用與對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用差異不顯著，對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用與對(duì)大腸桿菌的抑制作用差異不顯著。大葉胡頹子莖乙酸乙酯部位對(duì)供試菌抑制作用順序?yàn)椋航瘘S色葡萄球菌>鮑曼不動(dòng)桿菌>肺炎克氏桿菌>大腸桿菌>銅綠假單胞菌。

2.2 大葉胡頹子莖正丁醇部位對(duì)供試菌的抑菌效果

大葉胡頹子莖正丁醇部位對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克氏桿菌和大腸桿菌都具有抑菌作用，且對(duì)5種供試菌的抑制作用存在極顯著性差異。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（表3）和多重比較（表4）可知，大葉胡頹子莖正丁醇部位對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制作用與對(duì)其他菌種的抑制作用有極顯著差異；對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用與對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎克氏桿菌、大腸桿菌的抑制作用有極顯著差異。對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎克氏桿菌、大腸桿菌的抑制作用差異不顯著。大葉胡頹子莖正丁醇部位對(duì)供試菌抑制作用依次為：鮑曼不動(dòng)桿菌>銅綠假單胞菌>金黃色葡萄球菌≈肺炎克氏桿菌≈大腸桿菌。

2.3 大葉胡頹子莖乙酸乙酯部位與正丁醇部位抑菌效果的比較

大葉胡頹子莖乙酸乙酯部位與正丁醇部位抑菌效果比較的情況見表5。由表5可見大葉胡頹子莖乙酸乙酯部位對(duì)5種供試菌抑菌作用的大小排序與正丁醇部位不同，乙酸乙酯部位對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑最大，而正丁醇部位對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的抑菌圈直徑最大。正丁醇部位對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌的抑制作用極顯著強(qiáng)于乙酸乙酯部位；對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用顯著弱于乙酸乙酯部位，對(duì)肺炎克氏桿菌和大腸桿菌的抑制作用與乙酸乙酯部位沒有顯著差異。綜合看來，正丁醇部位的抑菌效果強(qiáng)于乙酸乙酯部位。

3 小結(jié)與討論

1）大葉胡頹子莖乙酸乙酯部位與正丁醇部位對(duì)5種常見的呼吸道致病菌皆有較強(qiáng)的抑菌作用，表明其抗菌譜較廣。正丁醇部位的綜合抑菌效果強(qiáng)于乙酸乙酯部位，且兩個(gè)部位對(duì)不同菌種的抑菌效果不同，說明兩者的抑菌成分不同，具有進(jìn)一步研究的意義。

2）試驗(yàn)明確了大葉胡頹子莖正丁醇部位和乙酸乙酯部位為抑菌的活性部位，為尋找大葉胡頹子莖中的抑菌活性成分奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也進(jìn)一步闡明了大葉胡頹子的藥用價(jià)值。大葉胡頹子在食用及觀賞等方面均值得深入研究。

3）分離純化大葉胡頹子莖中的活性成分，明確其分子結(jié)構(gòu)，將進(jìn)一步促進(jìn)其醫(yī)藥價(jià)值的利用。

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