基于代謝途徑分析的多殺菌素高產(chǎn)菌株選育

摘要：通過對刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）多殺菌素代謝合成途徑的分析，提出了一種代謝控制育種策略和提高誘變篩選效率的方法。以刺糖多孢菌QYLZ 88912菌株為出發(fā)菌株，選擇不同照射時間分別對其進行紫外線照射處理，然后用含有不同抗性物質(zhì)的搖瓶對誘變菌進行初篩，最終篩選出了1株高產(chǎn)多殺菌素的多抗性菌株SG+St+Er+-088。該菌株同時具有磺胺胍、鏈霉素和紅霉素抗性，搖瓶發(fā)酵試驗表明， 發(fā)酵7 d多殺菌素濃度可以達到1 132.60 mg/L，較出發(fā)菌株提高了85.4%，經(jīng)傳代試驗證明此菌株高產(chǎn)遺傳特性穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：代謝途徑；代謝控制育種；多殺菌素；菌落形態(tài)

中圖分類號：Q819； Q815 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）10-2309-06

當(dāng)前中國農(nóng)藥的應(yīng)用可以簡單地總結(jié)為農(nóng)藥品種多、質(zhì)量低、用量大、效率低、農(nóng)產(chǎn)品中殘留量高，對環(huán)境污染嚴重[1]，因此開發(fā)高效綠色的新型農(nóng)藥顯得尤為重要。多殺菌素（Spinosad）又稱刺糖菌素，是由刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）通過有氧發(fā)酵聚酮合成途徑合成的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，兼有化學(xué)農(nóng)藥的速效性和生物農(nóng)藥的安全性，不會對環(huán)境產(chǎn)生污染，對魚、畜、禽安全系數(shù)高。多殺菌素作為一種綠色生物農(nóng)藥，其具有殺蟲譜廣、作用方式獨特、殺蟲活性高、半衰期短、殘留低、無抗藥性、對人畜無害、環(huán)境污染少等優(yōu)點[2]，是一種具有觸殺及胃毒毒性的新型微生物源殺蟲劑，于1999年獲得美國“總統(tǒng)綠色化學(xué)品挑戰(zhàn)獎”[3]，在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景，該類產(chǎn)品的開發(fā)也具有良好的經(jīng)濟效益和社會效益。

刺糖多孢菌屬于糖多孢菌屬（Saccharopolyspora），是迄今發(fā)現(xiàn)的惟一可以通過好氧發(fā)酵產(chǎn)生多殺菌素的菌株。目前國外多殺菌素的研究領(lǐng)域已延伸到開發(fā)殺蟲活性更高、生物安全性更好的衍生物上。國內(nèi)對發(fā)酵生產(chǎn)多殺菌素的研究起步晚，最近幾年也取得了很大的進展，但較國外研究水平還有很大的差距[4]。國內(nèi)報道多殺菌素高產(chǎn)菌株較高生產(chǎn)水平為800～1 260 mg/L[5，6]，而國外早在10多年前就實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。多殺菌素的制備方法主要為微生物液體發(fā)酵合成，生物合成多殺菌素具有突出的優(yōu)點，工藝條件較易控制、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、提取較為方便，但微生物液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)多殺菌素產(chǎn)量很低，主要問題是缺乏高產(chǎn)菌株，以致影響了該物質(zhì)的應(yīng)用。因此篩選高產(chǎn)菌株，為中國農(nóng)藥領(lǐng)域開辟新型綠色產(chǎn)品，對農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義。試驗運用理性篩選思路和高效誘變方法，篩得高產(chǎn)菌株，并對其進行生物化學(xué)和遺傳學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

刺糖多孢菌QYLZ 88912菌株，由天津北洋百川生物技術(shù)有限公司保藏。

1.2 培養(yǎng)基

保藏分離培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g/L，葡萄糖5 g/L，酵母提取物3 g/L，玉米漿10 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，瓊脂20 g/L，pH 6.5～6.7 ， 121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g/L，葡萄糖5 g/L，酵母提取物3 g/L，玉米漿10 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，pH 6.5～6.7，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 40 g/L，可溶性淀粉 30 g/L，玉米浸液 15 g/L，棉子濃縮粉 20 g/L，酵母粉 20 g/L，碳酸鈣 3 g/L，pH 7.0～7.2 ， 121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.3 主要試劑

試驗所用主要試劑情況見表1。

1.4 菌株QYLZ 88912對所用抗性物質(zhì)的耐受上限試驗

將出發(fā)菌株的孢子懸浮液涂布于含有不同抗性物質(zhì)、不同設(shè)計水平的平板，每個處理做3個平行，在相對濕度70%～80%、29 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～9 d，觀察抗性平板的菌株生長情況，確定出發(fā)菌株對所用抗性物質(zhì)的致死（耐受）上限。

1.5 菌株的誘變處理

1.5.1 孢子懸浮液的制備 選擇生長良好的多殺菌素出發(fā)菌株QYLZ 88912斜面菌種，用無菌生理鹽水將其孢子洗下，轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠的無菌三角瓶中振蕩30 min，使孢子充分分散，用脫脂棉過濾孢子懸浮液，并調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度為106～107個/mL，備用。

1.5.2 致死率測定 取處理好的孢子懸浮液于30 W紫外燈下30 cm處分別照射不同的時間進行誘變處理，將誘變后的孢子懸浮液梯度稀釋涂于保藏分離培養(yǎng)基平板，于29 ℃避光培養(yǎng)7～9 d，計算致死率。

1.6 分析方法

1.6.1 色譜分析 高效液相色譜儀Agilent technologies 1200 series；色譜柱Agilent Nucleosil 100-5 C18，5 μm，150 mm×4.6 mm；流動相甲醇-乙腈-2%乙酸銨水溶液，甲醇∶乙腈∶2% 乙酸銨水溶液（體積比）為 45∶45∶10；流速1.5 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長250 nm；柱溫35 ℃；檢測器為紫外線檢測器。

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 用色譜純甲醇溶解多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品，并配制成1 000 mg/L 的多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后再依次稀釋成800、600、450、300、200、100 mg/L的多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照1.6.1所給出的色譜條件進行HPLC檢測，每一個濃度3次重復(fù)，以多殺菌素A峰和D峰面積之和為縱坐標(biāo)、多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 多殺菌素的發(fā)酵與提取

采用500 mL三角瓶，裝液量為50 mL，29 ℃下240 r/min發(fā)酵7 d，取10 mL 新鮮的多殺菌素發(fā)酵液，加入等體積甲醇，于200 r/min下振蕩浸提2 h，15 000 r/min離心8 min，取上清液，過針孔過濾器后，用HPLC法測定上清液中多殺菌素的濃度。

1.8 統(tǒng)計分析

用SAS 2.0 統(tǒng)計分析軟件分析并對所得誘變株的產(chǎn)量數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.6.1的色譜條件和1.6.2所給出的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法，用HPLC檢測不同濃度多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，所得多殺菌素的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。線性回歸方程為y=5.706 7x-7.082 0，R2=0.999 59，說明該方程能很好地反映多殺菌素與響應(yīng)信號間的線性關(guān)系。

2.2 不同劑量紫外線照射的誘變效果

考慮到菌株對紫外線的耐受能力，研究測定了紫外線分別照射5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 s時的致死率，得到了致死率曲線（圖2），由圖2可知，隨著紫外線照射時間的延長，致死率增大。在紫外線照射時間為25 s時，致死率達到95%，在紫外線照射時間為5、15 s時，致死率分別為35%和70%。對于不同的菌株，由于在不同的致死率下其正突變的概率是不容易確定的，為了增加菌株的正突變，篩選出高產(chǎn)菌株，研究采用的紫外線誘變劑量為5、15、25 s，將經(jīng)過不同照射時間處理的孢子懸浮液混合后用于初篩。

2.3 菌株QYLZ 88912對所用抗性物質(zhì)的敏感上限

將出發(fā)菌株的孢子懸浮液涂布于含有抗性物質(zhì)的平板上培養(yǎng)7～9 d，然后觀察抗性平板上菌株生長情況，結(jié)果見表2。從表2可以看出菌株QYLZ 88912對磺胺胍的耐受上限為5 mg/L，對鼠李糖的耐受上限為 8 g/L，對丙酸鈉、鏈霉素和紅霉素的耐受上限分別為10 g/L、6 mg/L和30 mg/L。為了得到能耐受這些物質(zhì)的抗性菌株，試驗選擇磺胺胍10 mg/L、鼠李糖12 g/L、丙酸鈉15 g/L、鏈霉素12 mg/L、紅霉素40 mg/L作為誘變后混合菌液的初篩濃度。

2.4 菌株的篩選策略與結(jié)果

選擇5、15、25 s照射時間分別對菌株QYLZ 88912的孢子懸浮液進行紫外線照射處理，然后把3個不同照射時間的孢子懸浮液混合均勻，進行10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6 3個稀釋度的孢子懸浮液涂布平板，29 ℃避光培養(yǎng)9～12 d。將長出的誘變菌株接種到含有10 mg/L磺胺胍的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，29 ℃恒溫搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)3～4 d，能夠生長的即為具有磺胺胍抗性的誘變菌。再將此種子液以10%接種量（體積分數(shù)，下同）接種到含有12 mg/L鏈霉素的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能夠生長的即為兼有磺胺胍抗性和鏈霉素抗性的誘變菌。再將本次獲得的種子液以10%接種量接種到含有40 mg/L紅霉素的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能夠生長的即為兼有磺胺胍、鏈霉素和紅霉素抗性的誘變菌。再將此次獲得的種子液以10%接種量接種到含有12 g/L鼠李糖的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能夠生長的即為兼有磺胺胍、鏈霉素、紅霉素和鼠李糖抗性的誘變菌。最后再將此步獲得的種子液以10%接種量接種到含有15 g/L丙酸鈉的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能夠生長的即為兼有磺胺胍、鏈霉素、紅霉素、鼠李糖和丙酸鈉5種物質(zhì)抗性的誘變菌。

按照上述方法，依次將篩到的抗性標(biāo)記菌株菌液交叉接入含有其他抗性物質(zhì)的搖瓶里，最終分別得到了SG+系列、SG+St+系列、SG+St+Er+系列、SG+Rh+St+Er+系列的抗性標(biāo)記菌株種子液。將每步得到的不同抗性標(biāo)記菌株的種子液都做10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6 3個稀釋度的孢子懸浮液涂布保藏分離培養(yǎng)基平板，29 ℃培養(yǎng)9～12 d，挑選具有特殊形態(tài)的菌落。最終共挑出452株誘變菌株，平板劃線分離后，每株保藏3支斜面，按1.7的方法進行搖瓶復(fù)篩。選取其中有代表性的16株菌，其菌落形態(tài)和產(chǎn)量見表3。最終篩出了1株具有磺胺胍、鏈霉素和紅霉素3種抗性的正突變菌株SG+St+Er+-088，多殺菌素產(chǎn)量為1 132.60 mg/L，SD為40.34，穩(wěn)定性良好。比出發(fā)菌株QYLZ 88912的產(chǎn)量提高了85.4%。

在進行大批量的挑菌篩菌過程中，出現(xiàn)各種形態(tài)的菌落（圖3），后續(xù)試驗發(fā)現(xiàn)梅花狀、正面白色、表面干燥、孢子豐滿、質(zhì)地較為均勻的菌株正突變的概率較大；表面褶皺、乳頭狀、邊緣不規(guī)則、中部凹陷、孢子不豐滿、奇形怪狀的菌落負突變的概率較大。依據(jù)菌落形態(tài)特征來挑選那些正突變概率較大的菌株，之后再用于搖床復(fù)篩，這樣可以提高篩菌效率，有效篩得高產(chǎn)菌。

借助菌落形態(tài)進行誘變初篩可以提高篩選效率，尤其是對于放線菌這類生長周期較長的菌株。但是這種方法對無菌培養(yǎng)和無菌操作過程要求比較嚴格，如果其中的一個環(huán)節(jié)染菌，就會導(dǎo)致整個抗性菌株篩選過程受到影響。

2.5 SG+St+Er+-088的遺傳穩(wěn)定性分析

將高產(chǎn)菌株SG+St+Er+-088在保藏分離培養(yǎng)基上連續(xù)傳代6次，其產(chǎn)孢速度基本一致；將各代菌株接入種子培養(yǎng)基，其進入對數(shù)生長期的時間和最高生物量基本一致；多殺菌素產(chǎn)量穩(wěn)定在1 080.87～1 191.12 mg/L（表4），表明該菌株遺傳特性穩(wěn)定。

2.6 統(tǒng)計分析結(jié)果

用SAS 2.0軟件對所得誘變株的產(chǎn)量進行差異顯著性檢驗（出發(fā)菌株產(chǎn)量為610.75 mg/L），結(jié)果見表5。由表5可知，誘變菌株SG+St+Er+-088和出發(fā)菌株QYLZ 88912之間存在顯著性差異；誘變菌株產(chǎn)量為1 132.60 mg/L，相對于出發(fā)菌株，產(chǎn)量提高85.4%，可以確定所篩出的誘變菌株SG+St+Er+-088為多殺菌素高產(chǎn)菌株。

3 小結(jié)與討論

3.1 代謝控制育種思路

3.1.1 紅霉素抗性菌株的選育 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的誘導(dǎo)抗性在許多鏈霉菌菌株中存在，此類抗生素作用于放線菌的核糖核蛋白體，抑制肽?；铣珊娃D(zhuǎn)移。紅霉素能與50S大亞基結(jié)合，并阻斷移位作用，將肽酰-tRNA“凍結(jié)”在A位點上[7，8]。誘導(dǎo)后的表型是23S核糖體RNA腺嘌呤中的N6-甲基化，使核糖體對所有的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素都呈抗性，此時大環(huán)內(nèi)酯類抗生素便開始合成[9]。

紅霉素與多殺菌素同屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，紅霉素抗性突變株可能部分解除終產(chǎn)物代謝調(diào)控作用，從而使多殺菌素的生物合成提前。本研究利用紅霉素對菌株QYLZ 88912進行抗性篩選以解除終產(chǎn)物代謝調(diào)控作用。

3.1.2 鼠李糖抗性菌株的選育 鼠李糖在刺糖多孢菌發(fā)酵生產(chǎn)多殺菌素的過程中，不僅是細胞壁的重要組成成分，也是多殺菌素合成過程中的一個重要的中間產(chǎn)物，其連接到糖苷配基上是糖苷配基轉(zhuǎn)換為多殺菌素的第一步，所以鼠李糖既是初級代謝的終產(chǎn)物，又是次級代謝產(chǎn)物多殺菌素合成的前體。因此，在多殺菌素發(fā)酵過程中需要大量的鼠李糖，如果其供應(yīng)不足，就會影響細胞生長和產(chǎn)物合成[10]，而如果鼠李糖積累過多，受到反饋抑制，也會影響多殺菌素的合成，所以必須去除鼠李糖的反饋調(diào)節(jié)。本研究利用鼠李糖對菌株QYLZ 88912進行抗性篩選，盡可能改變原始菌株的代謝調(diào)控機制，增加鼠李糖的積累量，滿足細胞生長和產(chǎn)物合成的需要，提高多殺菌素的產(chǎn)量。

3.1.3 丙酸鈉抗性菌株的選育 多殺菌素在結(jié)構(gòu)上是聚酮類物質(zhì)，多殺菌素聚酮體的形式是以丙酸為起始單位，按A-A-P-A-A-A-A-A-A-A（A-乙酰，P-丙酰）的順序添加10個?；s合而成的，所以丙酸是多殺菌素合成的一個重要的前體。添加外源性前體物質(zhì)有利于次級代謝物的合成，但過量的前體物質(zhì)對菌體有毒害和抑制作用[11，12]。本研究利用丙酸鈉對菌株QYLZ 88912進行抗性篩選，以期獲得對前體耐受性高的多殺菌素突變菌株。

3.1.4 磺胺胍抗性菌株的選育 磺胺胍可以弱化能量代謝途徑，篩選具有磺胺胍抗性的菌株，可以強化代謝流，增加多殺菌素的合成代謝能力，同時能增加菌株生長活力，在培養(yǎng)過程中，減少雜菌污染的幾率。

3.1.5 鏈霉素抗性菌株的選育 在抗生素生物合成調(diào)控機理的研究中發(fā)現(xiàn)，特異性調(diào)節(jié)基因和其他調(diào)節(jié)基因的過量表達，都可以誘導(dǎo)抗生素的過量合成。對于核糖體結(jié)構(gòu)的修飾和改造主要分為對翻譯元件的修飾改造和對轉(zhuǎn)錄元件的修飾改造兩方面的內(nèi)容。鏈霉素抗性（Str）突變屬于對翻譯元件的修飾改造[13]。四磷酸鳥苷酸（ppGpp）在細胞形態(tài)分化（如氣生菌絲和孢子的形成）和啟動次級代謝產(chǎn)物（如抗生素、色素和酶等）的生物合成中起著很重要的作用，它的合成基因是relA。當(dāng)微生物菌株的relA基因發(fā)生突變時，微生物便不能合成ppGpp，其次級代謝產(chǎn)物也不能生產(chǎn)。但是如果在該relA突變菌株中引入rpsL基因（編碼核糖體蛋白 S12），會發(fā)現(xiàn)在ppGpp合成能力沒有恢復(fù)的情況下就能讓其恢復(fù)產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的能力[14]，從而增加刺糖多孢菌的產(chǎn)抗生素水平。試驗利用鏈霉素對菌株QYLZ 88912進行抗性篩選，激活其產(chǎn)生抗生素的潛能。

3.2 結(jié)論

試驗將代謝控制育種的思路與高效篩選策略應(yīng)用于多殺菌素高產(chǎn)菌株的初篩，在試驗過程中，選擇不同照射時間對出發(fā)菌株進行紫外線照射處理，將得到的孢子懸浮液混合之后，運用含有不同抗性物質(zhì)的搖瓶對誘變菌進行連續(xù)的篩選，篩到了具有不同抗性物質(zhì)標(biāo)記的菌株，得到1株高產(chǎn)多殺菌素的多抗性菌株SG+St+Er+-088，該菌株同時具有磺胺胍、鏈霉素和紅霉素抗性，搖瓶發(fā)酵表明，發(fā)酵7 d多殺菌素濃度可達到1 132.60 mg/L，較出發(fā)菌株提高了85.4%，經(jīng)傳代試驗表明此菌株的高產(chǎn)遺傳特性穩(wěn)定。

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