棗瘋病植原體的超低溫保存研究

摘要：分別采用包埋玻璃化法、玻璃化法、簡化玻璃化法、一般低溫保存法對棗瘋病愈傷組織、棗瘋病組培苗莖尖及帶腋芽莖段、健康婆棗組培苗莖尖及帶腋芽莖段、長春花組培苗莖尖及莖段、長春花栽培苗莖尖及莖段進行了低溫（-20、-76、-196 ℃）保存研究。結(jié)果表明，長春花只有組培苗莖尖在液氮（-196 ℃）中保存48 h后恢復(fù)培養(yǎng)成功，而其他溫度（-20、-76 ℃）、其他材料均不能成功恢復(fù)培養(yǎng)；所有棗樹材料低溫保存后進行恢復(fù)培養(yǎng)時均死亡。

關(guān)鍵詞：棗瘋?。恢苍w；超低溫保存

中圖分類號：S432.4，Q-33 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）10-2302-03

棗瘋?。↗ujube witche’s broom）是由植原體 （Phytoplasma）引起的一類病害，對棗樹的破壞力強，具有毀滅性，使中國棗產(chǎn)區(qū)遭受巨大損失。棗瘋病是由植物菌原體引起的果樹病害，科技人員對其進行了大量研究，也取得了較明顯的進展[1-4]。由于該病病原在體外培養(yǎng)困難且由葉蟬傳病等原因，給研究棗瘋病造成很大的不便。其一，植原體只能在活體寄主植物上繁殖和保藏，但棗樹為落葉樹種，長達5個月的休眠期（華北為11月至次年3月）和2～3個月的病原低濃度期（4～6月）給獲取毒源帶來很大困難。即使是在生長和發(fā)病期間也受樹齡、品種抗性、生長期和環(huán)境的影響，體內(nèi)的病菌濃度波動大。其二，到目前為止，植原體的保存只能通過室內(nèi)組培病苗繼代培養(yǎng)，保存過程中可能造成菌種衰弱及丟失等，達不到長期有效保存穩(wěn)定菌種的目的。研究棗瘋病菌的保存技術(shù)，獲得穩(wěn)定的植原體菌株可為棗瘋病的科學研究提供便捷條件。長春花黃化病是由植物菌原體引起的一種病害，其病原與棗瘋病病原同屬一種，但長春花為一種多年生草本植物，以生長快速的長春花為材料可以建立長春花-棗樹菌原體感染系統(tǒng)，為研究棗瘋病提供快捷的參照。試驗也對長春花的保存技術(shù)進行了探索。

超低溫保存是指在-80 ℃以下的低溫中保存種質(zhì)資源的一套技術(shù)。超低溫保存工具主要有干冰（-79 ℃）、超低溫冰箱（-150～-80 ℃）、液氮（-196 ℃）和液氮蒸氣相（-140 ℃）等，其中液氮最為常用。超低溫保存技術(shù)是目前惟一可行的、不需繼代的生物體長期保存方式。目前使用的超低溫保存方法主要有冷凍誘導脫水的超低溫保存法（經(jīng)典法、滴凍法、簡化法等）[5-10]、玻璃化超低溫保存法（預(yù)培養(yǎng)法、干燥法、預(yù)培養(yǎng)干燥法、玻璃化法、包埋脫水法、包埋玻璃化法等）[11-13]。研究采用了包埋玻璃化法超低溫保存、玻璃化法超低溫保存、簡化玻璃化法超低溫保存和一般低溫保存法保存對棗瘋病植原體的不同攜帶材料進行了保存試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 患棗瘋病的婆棗組織培養(yǎng)苗（簡稱棗瘋病組培苗）、患棗瘋病的婆棗的愈傷組織（簡稱棗瘋病愈傷組織）、健康婆棗組培苗、長春花組培苗及栽培苗。

1.1.2 培養(yǎng)基 MS培養(yǎng)基；3號MS培養(yǎng)基：1/2 MS+0.6 mg/L ZT+6 mg/L NAA+15 g/L蔗糖+7.5 g/L瓊脂。

1.1.3 藥劑及設(shè)備 蔗糖、海藻酸鈉、移液管、CaCl2、甘油、二甲基亞砜、乙二醇、液氮、凍存管等。

1.2 方法

1.2.1 超低溫保存藥劑配制

1）含有0.03 g/mL的海藻酸鈉和0.4 mol/L蔗糖的無鈣離子改良MS培養(yǎng)基Ⅰ（用于棗瘋病組培苗莖尖包埋）。海藻酸鈉3 g，蔗糖13.69 g，1/10的1 L MS培養(yǎng)基大量元素、微量元素和有機酸成分（去除CaCl2），加水定容至100 mL，121 ℃滅菌30 min。

2）含有0.03 g/mL的海藻酸鈉和0.4 mol/L蔗糖的無鈣離子改良MS培養(yǎng)基Ⅱ（用于愈傷組織包埋）。海藻酸鈉3 g，蔗糖13.69 g，1/20的1 L MS培養(yǎng)基大量元素、微量元素和有機酸成分（去除CaCl2），加水定容至100 mL，121 ℃滅菌30 min。

3）含有0.4 mol/L蔗糖的0.1 mol/L CaCl2水溶液。蔗糖13.69 g，CaCl2 1.11 g，加水定容至100 mL，121 ℃滅菌30 min。

4）含有蔗糖的改良MS培養(yǎng)基Ⅰ（用于棗瘋病莖尖預(yù)培養(yǎng)）。蔗糖4.11 g，3/100的1L MS培養(yǎng)基大量元素、微量元素和有機酸成分，瓊脂0.27 g，加水定容至30 mL，121 ℃滅菌30 min。

5）含有蔗糖的改良MS培養(yǎng)基Ⅱ（用于愈傷組織預(yù)培養(yǎng)）。蔗糖4.11 g，3/200的1L MS培養(yǎng)基大量元素、微量元素和有機酸成分，瓊脂 0.27 g，加水定容至30 mL，121 ℃滅菌30 min。

6）PVS2。甘油30 mL、乙二醇15 mL、蔗糖13.69 g、水20 mL，121 ℃滅菌30 min；二甲基亞砜15 mL， 121 ℃滅菌30 min。使用前兩者混合均勻。

7）含有1.2 mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)基。蔗糖82.15 g，1/5的1 L MS大量元素、微量元素和有機酸成分，加水定容至200 mL，滅菌。

1.2.2 植物材料培養(yǎng)

1）棗瘋病愈傷組織的誘導。將棗瘋病組培苗基部用消毒剪刀剪掉部分組織，造成新鮮傷口，接種在3號MS培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（25 ℃、光周期12 h/12 h）。愈傷組織于原培養(yǎng)基上每月繼代1次。

2）長春花栽培苗的培養(yǎng)。在直徑為15 cm的培養(yǎng)皿底部鋪1 cm厚的滅菌土壤，將長春花種子均勻撒在表面，上層覆蓋0.3 cm厚的無菌河沙。從培養(yǎng)皿周圍澆入自來水，使土壤浸濕，組培室內(nèi)培養(yǎng)。待幼苗高3 cm左右時將其移栽到花盆中培養(yǎng)。

3）長春花組培苗的培養(yǎng)。以室內(nèi)栽培的長春花幼嫩莖段為外植體， 75%的乙醇浸30 s，1 mg/mL的氯化汞消毒2.5 min，無菌水沖洗5次，接種在MS培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 植物材料低溫保存和恢復(fù)培養(yǎng)

對棗瘋病愈傷組織、棗瘋病苗莖尖及帶腋芽莖段、健康長春花組培苗莖尖及帶腋芽莖段、健康婆棗組培苗莖段，長春花栽培苗莖段等采用不同的方法，于不同的低溫下進行了保存研究。

1）包埋玻璃化法超低溫保存。①包埋。將待處理植物材料懸浮在含有0.03 g/mL海藻酸鈉和0.4 mol/L蔗糖的無鈣離子改良MS培養(yǎng)基中。用無菌的膠頭吸管或5.0 mL吸頭（剪掉口端）吸取材料，轉(zhuǎn)移到含有0.4 mol/L蔗糖的0.1 mol/L CaCl2水溶液中，25 ℃下靜置30 min。②預(yù)培養(yǎng)。包埋丸在含有蔗糖的改良MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)1 d。③玻璃化液脫水。玻璃化液選用PVS2，預(yù)培養(yǎng)和裝載后的包埋丸用PVS2在0 ℃下處理1.5 ～4.0 h。④液氮保存。將經(jīng)玻璃化液脫水后的材料迅速投入液氮中保存。⑤化凍。將冷凍管迅速放入40 ℃水浴中解凍1～2 min，然后取出材料，用含有1.2 mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)基洗滌3～4次，并在此溶液中保持30 min。⑥恢復(fù)培養(yǎng)。將材料直接放在MS培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)。

2）玻璃化法超低溫保存。①脫水。植物材料放入2 mL的冷凍管中，室溫下加入預(yù)冷至0 ℃左右的冷凍保護劑處理40～60 min。②預(yù)培養(yǎng)。植物材料接種在含0.75 mol/L蔗糖的繼代培養(yǎng)基（MS+0.75 mol/L蔗糖）上預(yù)培養(yǎng)2 d。③預(yù)處理。在4 ℃冰箱中預(yù)處理45～60 min。④冷凍。將上述處理后的材料直接投入液氮中冷凍。⑤化凍和洗滌。37 ℃水浴中解凍1～2 min，吸去保護液，接入含有1.2 mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)基，室溫下停留10 min，然后用MS培養(yǎng)基對半洗滌2～3次。⑥恢復(fù)培養(yǎng)。將材料直接放在MS培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)。

3）簡化玻璃化法超低溫保存。將繼代培養(yǎng)的植物材料于5 ℃光照培養(yǎng)箱中低溫馴化21～35 d，無菌條件下切取莖尖置于固體培養(yǎng)基（MS+0.7 mol/L蔗糖）上預(yù)培養(yǎng)24～48 h，移入含1.5 mL PVS3（50%甘油+50%蔗糖）的冷凍管中處理80 ～100 min后直接投入液氮，分別保存24、48 h后取出冷凍管放入25 ℃水浴鍋中化凍1～2 min，然后接種到MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

4）一般低溫保存方法。分別配制20%DMSO、40%DMSO、60%DMSO、20%甘油、40%甘油、60%甘油、15%DMSO+30%甘油、20%DMSO+20%甘油、40%DMSO+40%甘油冷凍保護劑，分別取帶有腋芽的栽培植物莖段置于保護劑中，-20 ℃下處理7 d后將處理材料栽植于滅菌土壤中，組培室內(nèi)培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

長春花組培苗莖尖在-20 ℃保存7 d，-76 ℃保存7 d，-196 ℃保存48 h。結(jié)果表明，長春花組培苗莖尖只有在-196 ℃下保存48 h的處理在恢復(fù)培養(yǎng)時獲得成功，其他處理的長春花材料均因凍傷而未恢復(fù)生長。

其他材料經(jīng)低溫保存后，在恢復(fù)培養(yǎng)時全部因凍傷而死亡。經(jīng)多次重復(fù)試驗，未得到有效保存棗樹植物組織及棗瘋病植原體的方法。

棗樹為木本植物，而長春花為多年生草本植物，材料的不同類型可能是保存成功的關(guān)鍵因素，草本植物相對木本植物較易保存成功。

植物的低溫保存技術(shù)與多種因素有關(guān)，如材料本身的特性、材料冷凍前的處理、冷凍保護劑的種類和組合、冷凍的時間、冷凍和解凍的過程、冷凍后的處理、操作技術(shù)等。健康棗樹材料、棗瘋病植原體材料的低溫保存在本次試驗研究中未獲得成功，在今后的試驗中有必要綜合分析各種影響保存效果的因素以進一步深入探索。

3 小結(jié)與討論

棗樹組織的超低溫保存技術(shù)尚未見有關(guān)報道，本研究參照其他木本材料的保存方法，進行的不同低溫下棗樹組織的保存試驗效果并不理想，需要在今后的研究中進一步綜合考慮影響低溫保存的所有因素，改進方法，提高技術(shù)，再進行大量的試驗研究以達到超低溫保存植原體的目的。本試驗對棗樹材料及植原體的超低溫保存進行了初步的探索，為植原體的保存研究奠定了一定基礎(chǔ)。

低溫保存材料的選擇是影響保存效果的關(guān)鍵因素，如材料的生長狀況、取材部位等。一般應(yīng)用于研究的材料應(yīng)選擇生長健壯的莖尖或帶腋芽小莖段，健壯的材料才具有頑強的生命力。因此，培養(yǎng)健壯的植物材料是進行超低溫保存的前提。另外，組織培養(yǎng)材料的繼代次數(shù)、培養(yǎng)時間的長短也是需要考慮的關(guān)鍵因素。

植物細胞原生質(zhì)具有一定的忍受臨界溫度，如果低溫超過細胞原生質(zhì)體的忍受臨界溫度就會致使植物細胞遭受凍害而死亡；材料的基因型以及冷凍前材料所處的生理狀態(tài)均可影響其保存后的存活能力，一般來說，小且細胞質(zhì)濃厚的分生細胞比大且高度液泡化的成熟細胞容易存活，指數(shù)生長期和滯后期的細胞抗性最強，幼小的球形胚比老齡胚存活率高。

冷凍保護劑的種類繁多，常分為滲透性保護劑和非滲透性保護劑。常用的滲透性保護劑有甘油、二甲基亞砜、甲醇、丙二醇、葡萄糖等，這類保護劑能穿入細胞，降低溶液中溶質(zhì)濃度，使進入細胞內(nèi)的電解質(zhì)的量減少，減輕冷凍和復(fù)溫過程中細胞滲透性腫脹，減緩細胞皺縮的速度，減輕皺縮的程度，同時減少冰晶的形成；非滲透性的保護劑有蔗糖、卵黃等，這類保護劑不能穿透到細胞內(nèi)，它們能夠提高細胞外滲透壓，在冷凍過程中使細胞內(nèi)的水分向細胞外滲透，引起細胞脫水而皺縮，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而保護細胞免遭破壞。因此，在低溫保存過程中，根據(jù)不同材料的特性選用合適種類的冷凍保護劑是非常重要的。作為冷凍保護劑，應(yīng)具備相對分子質(zhì)量低、易溶于水、低濃度、對細胞無毒害、便于沖洗、進入細胞迅速等特點，最常用的是DMSO和甘油，其中DMSO是最有效的冷凍保護劑，常用保護劑的總濃度為0.2～2.0 mol/L，保護劑的加入應(yīng)在低溫下進行，高溫下會增加冷凍保護劑對細胞的毒害。

細胞傷害主要發(fā)生在冷凍過程中，為了防止凍害，必須阻止細胞內(nèi)冰晶的形成，這需要根據(jù)不同植物材料對凍害的敏感程度采用合適的降溫方法。

解凍后殘留于細胞內(nèi)的冷凍保護劑會影響保存材料的恢復(fù)和繼續(xù)生長，因此需要除去冷凍保護劑，在實際應(yīng)用中沒有必要將細胞內(nèi)的保護劑徹底去除，因為連續(xù)的清洗常會進一步損傷細胞。

包埋玻璃化法是包埋-脫水法和玻璃化法的結(jié)合，此法經(jīng)海藻酸鈉包埋后減輕了玻璃化液的毒性，提高了存活率，但是，包埋材料海藻酸鈉小珠的大小可影響到保存后的存活率。玻璃化法超低溫保存材料在玻璃化處理之前先用濃度較低的低溫保護劑預(yù)處理，有些植物材料可以直接處理，處理溫度、外植體和保存容器也影響保存后的存活率。

木本植物材料的超低溫保存影響因素較多，在研究過程中要根據(jù)材料的特性選擇適合的保存方法，了解每個步驟在保存過程中所起到的主要作用，努力掌握好每一環(huán)節(jié)的藥劑使用、操作過程等，盡量減少外界因素對試驗的影響，綜合考慮影響因素，以期達到成功保存的目的。

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