藍莓菌根真菌液體培養(yǎng)條件的正交試驗優(yōu)化

摘要：采用正交試驗設計研究不同溫度、pH、不同碳源和氮源等因子對一株藍莓菌根真菌生長的影響。結(jié)果表明，4種因子對菌根真菌生長的影響程度依次為pH、氮源、溫度和碳源，其中，pH對菌根真菌的生長有顯著影響。菌根真菌最適宜液體培養(yǎng)條件為pH 6，溫度30 ℃，碳源為淀粉、氮源為蛋白胨的改良MMN培養(yǎng)基。

關(guān)鍵詞：藍莓（Vaccinium uliginosum L.）；菌根菌；培養(yǎng)條件；溫度；pH；碳源；氮源

中圖分類號：Q93-335 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）10-2268-02

藍莓（Vaccinium uliginosum L.）屬杜鵑花科（Ericaceae）越桔屬（Vaccinium）植物，其果實除含有一般水果中的有機酸、維生素和礦物質(zhì)外，還含有豐富的花青素、不飽和脂肪酸、鞣花酸及微量元素鉀、鈣、鋅、鐵等，VE和B族維生素的含量也比較高[1]。據(jù)美國農(nóng)業(yè)部人類營養(yǎng)研究中心的研究報道，藍莓的抗氧化作用列各種水果、蔬菜之首。它是抗癌、預防血栓及動脈硬化、抗泌尿系統(tǒng)感染、預防心臟疾病和延緩衰老的非常可靠的保健食品，被國際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一[2]。

藍莓為淺根系植物，根系不發(fā)達，無根毛，根纖細，呈纖維狀，主要分布在淺土層。藍莓根系一般水平分布范圍在樹冠的投影區(qū)域內(nèi)，深度為30～45 cm，因此藍莓對土壤條件要求嚴格，其中土壤pH、土壤水分、透氣性、排水性等條件對藍莓生長有很大影響，不適宜的土壤條件常導致藍莓栽培失敗，藍莓通常在有機質(zhì)含量高、土壤通氣性良好和水分充足而穩(wěn)定的酸性沙質(zhì)土壤中生長良好[3，4]。但在自然狀態(tài)下，藍莓根系與菌根真菌共生形成菌根。目前已發(fā)現(xiàn)浸染藍莓的菌根真菌有10余種。值得注意的是，幾乎所有藍莓的細根都有內(nèi)生菌根真菌的寄生，從而解決了藍莓根系由于沒有根毛造成的對水分及養(yǎng)分吸收能力下降的問題。菌根真菌的侵染對藍莓的生長發(fā)育及養(yǎng)分吸收起著重要作用[5-8]。

菌根真菌菌株MF002[晶粒鬼傘（Coprinus micaceus）MF002]屬于傘菌目、鬼傘科、鬼傘屬，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學院微生物中心從野生藍莓中分離篩選。接種菌根真菌菌株MF002可以顯著促進藍莓生長、增加藍莓鮮果的花青素、鞣花酸含量。但目前關(guān)于藍莓菌根真菌的純培養(yǎng)研究尚少。因此，采用正交試驗設計研究不同因子對分離自藍莓根部的菌根真菌菌株MF002液體培養(yǎng)的影響，旨在探索適宜于其生長的最佳條件，以期為菌絲體的擴繁和菌劑生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 供試菌株MF002[晶粒鬼傘（Coprinus micaceus）MF002]，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學院微生物中心提供，分離自野生藍莓根內(nèi)。

1.1.2 固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基 改良MMN培養(yǎng)基。CaCl2·2H2O 0.05 g，麥芽粉3 g，NaCl 0.025 g，葡萄糖10g，KH2PO4 0.5 g，牛肉膏蛋白胨15 g，（NH4）2HPO4 0.25 g，維生素B1 0.1mg，MgSO4·7H2O 0.15 g， FeCl3（1%溶液）1.2 mL，瓊脂20g，去離子水1 000 mL。

1.2.3 液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基 按照正交試驗設計，將改良MMN培養(yǎng)基中的碳源（葡萄糖+麥芽汁）分別用20 g/L的葡萄糖、麥芽糖、乳糖和可溶性淀粉替代，用0.25 g/L的無機氮源[（NH4）2HPO4、NH4NO3、KNO3]和3 g/L的有機氮源（蛋白胨）替代培養(yǎng)基中的氮源[（NH4）2HPO4+麥芽汁]，制成液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 將菌株MF002接種于改良的MMN固體培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)4 d，備用。

1.2.2 搖床培養(yǎng) 將配制好的液體培養(yǎng)基分裝到100 mL三角瓶中，每瓶50 mL，在121 ℃、0.05 MPa條件下滅菌20 min，冷卻后每瓶定量接種1塊直徑為7 mm的活化菌餅，每處理3次重復。150 r/min條件下培養(yǎng)7 d。

1.2.3 菌絲體干重的測量 將三角瓶中發(fā)酵液及菌絲體過濾，于80 ℃烘箱中烘干，記錄菌絲體干重。

1.2.4 試驗設計 采用L9（34）正交試驗設計，試驗因素與水平見表1。

1.2.5 統(tǒng)計方法 培養(yǎng)7d后進行生物量測定。試驗數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計分析軟件和Microsoft excel 進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

試驗結(jié)果（表2）表明，9個處理的菌絲體干重平均值存在差異，在處理6的培養(yǎng)條件下，MF002的菌絲體干重顯著高于其他處理，為0.117 4 g/（50 mL）。由此得出菌株MF002的最佳液體培養(yǎng)條件為pH 6，溫度30 ℃，碳源為淀粉、氮源為蛋白胨的改良MMN培養(yǎng)基。

3 小結(jié)

通過L9（34）正交試驗初步確定了MF002菌株最佳液體培養(yǎng)條件為pH 6，溫度30 ℃，碳源為淀粉、氮源為蛋白胨的改良MMN培養(yǎng)基，此條件下MF002菌絲體干重平均為0.117 4 g/（50 mL）。研究可為今后藍莓菌根真菌的規(guī)?；a(chǎn)提供參考。

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