低溫產(chǎn)甲烷復(fù)合菌系的選育及干、濕發(fā)酵的比較

摘要：將3個(gè)低溫厭氧環(huán)境樣品Y、S、Z進(jìn)行干、濕發(fā)酵低溫馴化，選育適宜低溫干、濕發(fā)酵的穩(wěn)定、高效產(chǎn)甲烷復(fù)合菌系。樣品Y、S、Z在（19±0.5）℃條件下進(jìn)行干發(fā)酵低溫馴化，分別在第6代、第7代、第6代產(chǎn)氣基本穩(wěn)定，第8代65 d總產(chǎn)氣量分別為42.60、40.50、41.70 L，總固體（TS）產(chǎn)氣率分別為266.25、253.13、260.63 L/kg。復(fù)合菌系Y最適接種量為25%，甲烷含量最高為72.9%，COD去除率最高為77.17%；樣品Y、S、Z在相同條件下進(jìn)行濕法酸化發(fā)酵低溫馴化，分別在第7代、第7代、第8代產(chǎn)氣基本穩(wěn)定，第9代55 d總產(chǎn)氣量分別為35.48、34.52、33.78 L，TS產(chǎn)氣率分別為221.75、215.75、211.13 L/kg； 3組復(fù)合菌系穩(wěn)定世代在干發(fā)酵和濕法酸化發(fā)酵中均使得沼氣發(fā)酵啟動(dòng)期比第1代提前5 d以上。經(jīng)差異顯著性分析，相同發(fā)酵方法下不同復(fù)合菌系間總產(chǎn)氣量差異達(dá)到顯著水平。

關(guān)鍵詞：低溫馴化；沼氣發(fā)酵類型；總產(chǎn)氣量；甲烷純度；COD

中圖分類號：Q933；TQ920.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）10-2260-04

溫度是限制低溫沼氣發(fā)展的重要因素，低于20 ℃時(shí)沼氣發(fā)酵效率會(huì)顯著下降，我國北方年平均氣溫為1.3 ℃，若在低溫季節(jié)進(jìn)行沼氣發(fā)酵需人為加熱保溫，增加了運(yùn)行成本，而使得沼氣發(fā)酵難以在北方推廣。此外，濕發(fā)酵沼液量大，處置不當(dāng)易造成二次污染，若干發(fā)酵替代濕發(fā)酵不僅利用秸稈解決生物質(zhì)能轉(zhuǎn)化問題，而且減少其焚燒所帶來的空氣污染[1]。試驗(yàn)采用不同生境來源的樣品，利用微生物對環(huán)境適應(yīng)性及溫度對其的選擇作用在干、濕發(fā)酵中進(jìn)行低溫馴化，比較干、濕發(fā)酵優(yōu)越性并且選育穩(wěn)定、高效、適宜低溫干、濕發(fā)酵的產(chǎn)甲烷復(fù)合菌系，為低溫沼氣工程提供試驗(yàn)參數(shù)及菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 樣品選擇厭氧污泥Y、水稻田污泥S、沼氣發(fā)酵液Z。

1.1.2 底物及試劑 牛糞酸化液：將9 kg干牛糞與9L水在塑料桶里混合均勻，自然酸化待pH降至6時(shí)，用KHCO3溶液將其pH調(diào)至7，裝料時(shí)將TS調(diào)至8%。

未酸化底物：將9 kg干牛糞與3 kg粉碎的秸稈充分混合[2]，加水?dāng)嚢杈鶆?，裝料時(shí)將TS調(diào)至20%作為干發(fā)酵底物[3]；將TS調(diào)至8%作為未酸化物料濕發(fā)酵底物。

試劑：1/6 K2Cr2O2=0.100 0 mol/L、[（NH4）2Fe（SO4）2·6H2O]=0.1 mol/L、消解液、Ag2SO4-H2SO4催化劑、鄰菲羅啉指示劑、掩蔽劑、KHCO3等。

1.2 方法

1.2.1 干法馴化 將樣品Y、S、Z分別接入盛有0.8 kg的干發(fā)酵底物（TS為20%）的3 L塑料瓶中，3次重復(fù)。密封后放入（19±0.5） ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；定期測定產(chǎn)氣量及CH4含量，將產(chǎn)氣量、CH4含量高的培養(yǎng)物繼代培養(yǎng)至性能穩(wěn)定為止。

1.2.2 濕法馴化 將樣品Y、S、Z分別接入盛有1L牛糞酸化液和1L未酸化物料TS 為8%的3 L玻璃瓶中，3次重復(fù)。密封后放入（19±0.5） ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；定期測定產(chǎn)氣量及CH4含量，將產(chǎn)氣量、CH4含量高的培養(yǎng)物繼代培養(yǎng)至性能穩(wěn)定為止。

1.2.3 產(chǎn)氣量與氣體成分測定 采用排水法測定產(chǎn)氣量；采用GC-14C2010氣相色譜進(jìn)行氣體成分分析。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析方法 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics-V19.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用LSR最小顯著極差法進(jìn)行多重比較。

1.2.5 干發(fā)酵不同接種量 干發(fā)酵中將復(fù)合菌系Y按接種量20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%分別接入試驗(yàn)組中，設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.6 干發(fā)酵COD去除率 取干發(fā)酵原料測初始COD，接種25%低溫產(chǎn)甲烷復(fù)合菌系Y后密封培養(yǎng)，每隔6 d測甲烷濃度并取其發(fā)酵物測COD，計(jì)算COD去除率，設(shè)置3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干發(fā)酵總產(chǎn)氣量動(dòng)態(tài)變化

由圖1可知，3個(gè)樣品的總產(chǎn)氣量隨著傳代次數(shù)增加而增加。樣品Y從第2代起每代總產(chǎn)氣量都高于S和Z，第6代時(shí)樣品Y和Z產(chǎn)氣開始穩(wěn)定，第7代時(shí)樣品S產(chǎn)氣開始穩(wěn)定。樣品Y第8代65 d總產(chǎn)氣量為42.60 L，較第1代提高47.4%，產(chǎn)氣啟動(dòng)期較第1代提前7 d，產(chǎn)氣量優(yōu)于樣品S和Z。

2.2 濕法酸化發(fā)酵總產(chǎn)氣量動(dòng)態(tài)變化

如圖2所示，濕法酸化發(fā)酵復(fù)合菌系世代間總產(chǎn)氣量變化規(guī)律同干法。樣品Y從第4代起總產(chǎn)氣量都高于S和Z，平均分別提高5.68%和5.53%，樣品Y和S在第7代產(chǎn)氣開始穩(wěn)定，樣品Z在第8代時(shí)產(chǎn)氣開始穩(wěn)定。樣品Y第9代55 d總產(chǎn)氣量為35.48 L，較第1代提高36.58%，產(chǎn)氣啟動(dòng)期較第1代提前6 d，產(chǎn)氣量優(yōu)于樣品S和Z。

2.3 不同發(fā)酵方法對復(fù)合菌系Y產(chǎn)氣量的影響

2.3.1 不同發(fā)酵方法對復(fù)合菌系Y總產(chǎn)氣量的影響 如圖3所示，樣品Y干發(fā)酵與濕法酸化發(fā)酵每代總產(chǎn)氣量都高于濕法未酸化發(fā)酵，第8代干發(fā)酵與濕法酸化發(fā)酵總產(chǎn)氣量較濕法未酸化發(fā)酵提高50.84%和38.33%。干發(fā)酵前兩代總產(chǎn)氣量低于濕法酸化發(fā)酵，經(jīng)馴化后第6代產(chǎn)氣高于濕法酸化發(fā)酵。經(jīng)熒光顯微鏡及電鏡掃描觀測到菌系中以八疊球菌為主[4]。由于干發(fā)酵物料中纖維素含量高，發(fā)酵性菌群分泌的纖維素酶將大量纖維素分解成單糖，單糖被進(jìn)一步分解成乙酸、氫氣和二氧化碳等[5]，產(chǎn)甲烷菌直接利用前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化成甲烷，由于底物濃度大，前體物質(zhì)的生成得到保障，因此產(chǎn)氣量高。而牛糞自然酸化過程中，發(fā)酵菌群已將大分子有機(jī)質(zhì)分解成能溶于水的小分子化合物，接種復(fù)合菌系后發(fā)酵菌群與產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌直接將小分子化合物轉(zhuǎn)化為乙酸、氫氣、二氧化碳等產(chǎn)甲烷前體物質(zhì)，使得產(chǎn)甲烷前體物質(zhì)充分供給，因此，產(chǎn)氣量高于濕法未酸化發(fā)酵。

2.3.2 干發(fā)酵復(fù)合菌系Y對日產(chǎn)氣量的影響 干發(fā)酵低溫產(chǎn)甲烷復(fù)合菌系Y第8代日產(chǎn)氣量變化動(dòng)態(tài)如圖4所示。接種復(fù)合菌系Y后第2天開始產(chǎn)氣，產(chǎn)氣持續(xù)上升至第5天時(shí)有所下降，此階段氣體主要為CO2。第5天后產(chǎn)氣持續(xù)上升至17 d時(shí)達(dá)到峰值1 200 mL/d，之后緩慢下降趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定期日產(chǎn)氣量穩(wěn)定在800～900 mL一段時(shí)間后產(chǎn)氣一直下降。65 d產(chǎn)氣過程中CH4純度在50%以上的時(shí)間達(dá)到55 d。

2.3.3 濕法酸化發(fā)酵復(fù)合菌系Y對日產(chǎn)氣量的影響 濕法酸化發(fā)酵復(fù)合菌系Y第9代日產(chǎn)氣量變化動(dòng)態(tài)如圖5所示。接種復(fù)合菌系Y第2天開始產(chǎn)氣并持續(xù)上升至第5天時(shí)略有下降，此階段氣體成分以CO2為主，此后產(chǎn)氣持續(xù)上升至18 d時(shí)達(dá)到峰值1 100 mL/d，隨后產(chǎn)氣下降至21 d趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定期持續(xù)18 d日產(chǎn)氣量維持在650～900 mL，之后產(chǎn)氣一直下降。產(chǎn)氣55 d中CH4純度在50%以上時(shí)間達(dá)到44 d。

2.4 不同樣品產(chǎn)氣特性分析

目前中溫濕發(fā)酵8%的TS產(chǎn)氣率為218.0～262.0 L/kg[6]，中溫干發(fā)酵20%的TS產(chǎn)氣率為218.5～250.0 L/kg[7，8]。由表1可知，3個(gè)樣品干發(fā)酵與濕法酸化發(fā)酵總產(chǎn)氣量、甲烷含量及TS產(chǎn)氣率雖然有差異，但所選育的復(fù)合菌系Y、S、Z在干發(fā)酵和濕法酸化發(fā)酵中已達(dá)到或接近中溫產(chǎn)氣率水平，干發(fā)酵TS產(chǎn)氣率已超過濕法酸化發(fā)酵產(chǎn)氣率水平。統(tǒng)計(jì)分析表明，不同來源的樣品經(jīng)低溫馴化穩(wěn)定后其產(chǎn)氣性能有差異，相同發(fā)酵方法下低溫產(chǎn)甲烷復(fù)合菌系間總產(chǎn)氣量差異達(dá)顯著水平。因此，低溫產(chǎn)甲烷復(fù)合菌系馴化前的樣品采集要有針對性與選擇性。

2.5 干發(fā)酵不同接種量對復(fù)合菌系Y日均產(chǎn)氣量的影響

由圖6可知，隨著接種量的增加，日均產(chǎn)氣量緩慢遞增，接種量為25%時(shí)，日均產(chǎn)氣量達(dá)到最高，接種量大于25%時(shí)日均產(chǎn)氣量呈緩慢下降趨勢。這是因?yàn)閱?dòng)階段甲烷菌數(shù)量少且活性差，為使運(yùn)行中產(chǎn)生的大量有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為甲烷，避免有機(jī)酸積累，必須保證一定數(shù)量的甲烷菌，所以增加接種量日均產(chǎn)氣量增加[9]，但接種量過大時(shí)，導(dǎo)致發(fā)酵中總固體含量提高，發(fā)酵過程中容易產(chǎn)生過量的有機(jī)酸，引起發(fā)酵物料的酸化，pH下降，從而影響日均產(chǎn)氣量。因此，干發(fā)酵中復(fù)合菌系Y最適接種量為25%。

2.6 干發(fā)酵復(fù)合菌系Y COD與日產(chǎn)氣量的關(guān)系

如圖7所示，隨著日產(chǎn)氣量的增加COD呈下降趨勢，日產(chǎn)氣量增加幅度大時(shí)COD下降幅度也增大，日產(chǎn)氣量達(dá)峰值時(shí)COD下降幅度最大，發(fā)酵過程中COD的變化符合產(chǎn)氣變化規(guī)律。產(chǎn)氣高峰期大量有機(jī)質(zhì)中碳素被用于生成甲烷，因此COD下降幅度較大。干發(fā)酵低溫復(fù)合菌系Y第7代COD去除率達(dá)77.17%[10-12]。

3 結(jié)論

1）通過低溫馴化從不同厭氧樣品中選育出的復(fù)合菌系Y、S、Z干發(fā)酵分別在第6代、第7代、第6代產(chǎn)氣穩(wěn)定，第8代65d總產(chǎn)氣量分別為42.60、40.50、41.70 L，TS產(chǎn)氣率分別為266.25、253.13、260.63 L/kg；濕法酸化發(fā)酵分別在第7代、第7代、第8代產(chǎn)氣穩(wěn)定，第9代55 d總產(chǎn)氣量分別為35.48、34.52、33.78 L，TS產(chǎn)氣率分別為221.75、215.75、211.13 L/kg；不同復(fù)合菌系穩(wěn)定世代在干發(fā)酵和濕法酸化發(fā)酵中均使沼氣發(fā)酵啟動(dòng)期提前5 d以上，所選育的低溫復(fù)合菌系Y、S、Z在干發(fā)酵和濕法酸化發(fā)酵中已達(dá)到或接近中溫產(chǎn)氣水平。

2）復(fù)合菌系Y在干發(fā)酵與濕法酸化發(fā)酵中產(chǎn)氣效果均良好，干發(fā)酵中復(fù)合菌系Y接種量為25%時(shí)產(chǎn)氣效果最好，甲烷含量最高時(shí)為72.9%， COD去除率最高為77.17%。形態(tài)學(xué)觀察菌系中多以八疊球菌為主。

3）干發(fā)酵與濕法酸化發(fā)酵產(chǎn)氣效果好于濕法未酸化發(fā)酵；干發(fā)酵TS產(chǎn)氣率高于濕法酸化發(fā)酵水平。經(jīng)差異顯著性分析，相同發(fā)酵方法下不同復(fù)合菌系間總產(chǎn)氣量差異達(dá)到顯著水平。

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