水稻突變體Shuanglimi的光合特性

摘要：以水稻突變體Shuanglimi為試驗(yàn)材料，對(duì)其幼穗處于減數(shù)分裂期時(shí)劍葉的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、 葉片氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、水分利用率（WUE）和羧化效率（CE）、葉綠素含量及劍葉中維管束數(shù)目進(jìn)行了測(cè)定和觀察。結(jié)果表明，Shuanglimi 的Pn、WUE和CE較CK分別降低了（71.18±2.08）%， （72.00±2.51）%和（79.33±3.27）%（P<0.01），而其Tr和Ci與CK之間無(wú)顯著差異。Shuanglimi總?cè)~綠素含量較CK降低，尤其是葉綠素b含量大幅降低。同時(shí)，Shuanglimi劍葉中小維管束的數(shù)目較CK降低了（18.86±1.97）%（P<0.01），而大維管束中含有3個(gè)和4個(gè)導(dǎo)管的特異變化數(shù)目較CK明顯增加。由此可見(jiàn)，Shuanglimi的光合特性差異是其子粒和生殖特性差異形成的原因之一。

關(guān)鍵詞：水稻突變體Shuanglimi；光合作用；葉綠素含量；維管束

中圖分類號(hào)：S511.2+1；Q945.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）10-2250-04

在水稻的遺傳改良進(jìn)程中，豐富多彩的遺傳性變異個(gè)體為優(yōu)良新種質(zhì)的篩選與培育提供了廣泛的種質(zhì)資源?，F(xiàn)代生物技術(shù)在提高變異頻率，擴(kuò)大變異圖譜，縮短篩選周期、豐富變異類型等方面發(fā)揮著十分重要的作用[1]。在變異材料的創(chuàng)造過(guò)程中，各種突變體的出現(xiàn)為水稻的遺傳改良提供了有利的資源材料。在水稻突變體中，花器官突變體已成為當(dāng)今植物發(fā)育生物學(xué)和植物功能基因組學(xué)研究的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)。光合作用是將無(wú)機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為有機(jī)物質(zhì)并將太陽(yáng)光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)，它是水稻最基本的生理活動(dòng)以及生長(zhǎng)和發(fā)育的原動(dòng)力。光合作用效率是直接影響水稻生產(chǎn)力及產(chǎn)量高低的重要因素之一，是水稻遺傳改良中重要的考查指標(biāo)[2]。在此項(xiàng)研究中，水稻突變體Shuanglimi是利用離子束介導(dǎo)技術(shù)對(duì)秈稻進(jìn)行遺傳改良時(shí)在其后代中篩選到的一種表現(xiàn)出“雙粒米”特性的花器官突變體。經(jīng)過(guò)5個(gè)世代的純化，該突變體已經(jīng)穩(wěn)定，田間農(nóng)藝性狀表現(xiàn)一致，但其子粒性狀按照一定的頻率發(fā)生分離。以水稻突變體Shuanglimi為試驗(yàn)材料，對(duì)其生殖生長(zhǎng)期的光合作用以及與其相關(guān)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，旨在掌握水稻突變體Shuanglimi的光合特性，為進(jìn)一步研究其生殖特性和完善水稻突變體庫(kù)提供有價(jià)值的參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2006年，利用氮離子束介導(dǎo)技術(shù)將玉米（西星赤糯1號(hào)）DNA轉(zhuǎn)化到受體材料IR36（CK）中，在其當(dāng)代群體中產(chǎn)生了1株具有“雙粒米”特性的突變體。此突變體經(jīng)過(guò)5個(gè)世代的純化和篩選后獲得了遺傳上穩(wěn)定的株系。該株系的主要農(nóng)藝性狀整齊一致，穎殼比較長(zhǎng)且呈開(kāi)穎狀態(tài)，群體中大部分穎花表現(xiàn)為高度不育，而少部分穎花可實(shí)現(xiàn)自交結(jié)實(shí)，由此可以分離出雙粒米子粒（圖1）。根據(jù)其子粒特性，此突變體被命名為Shuanglimi。細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Shuanglimi產(chǎn)生“雙粒米”的原因是小穗分化時(shí)形成雙子房，故此突變體是一種雙子房花器官突變體。為了進(jìn)一步系統(tǒng)地研究該突變體的生理特性，2012年5月將試驗(yàn)材料種植于河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所的試驗(yàn)田中， 采用常規(guī)管理，在生殖生長(zhǎng)期對(duì)其光合特性進(jìn)行了研究與分析。在突變體創(chuàng)造過(guò)程中，供體玉米來(lái)自于山東省萊州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，受體材料來(lái)自于實(shí)驗(yàn)室多年采用的具有穩(wěn)定遺傳基礎(chǔ)的試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 光合作用參數(shù)的測(cè)定 在水稻處于生殖生長(zhǎng)期，當(dāng)劍葉葉耳與倒二葉葉耳相平時(shí)（此時(shí)幼穗發(fā)育正處于減數(shù)分裂期），兩種試驗(yàn)材料各選擇30株長(zhǎng)勢(shì)均一、生長(zhǎng)良好的單株。按照楊秋云等[3]的方法，選擇晴朗的天氣，上午10∶30，借助Li-6400光合作用測(cè)定儀采用開(kāi)路測(cè)量法對(duì)其劍葉中部進(jìn)行光合作用參數(shù)測(cè)定。對(duì)于同一單株連續(xù)測(cè)量3 d，視為3次重復(fù)。

1.2.2 葉綠素含量的測(cè)定 葉綠素含量的測(cè)定采用化學(xué)方法[4]。稱取0.5 g 新鮮的劍葉剪碎放入研缽，加入少量的石英砂和碳酸鈣及5 mL純丙酮，充分研磨成勻漿，再加入80%丙酮5 mL，在暗處?kù)o置10 min，充分提取色素。過(guò)濾，用乙醇定容到25 mL，搖勻。以95%的乙醇為空白對(duì)照，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分別在663 nm和645 nm處測(cè)其吸光度，3次重復(fù)。

1.2.3 大、小維管束觀察 參照李金才等[5]的方法選取合適的劍葉利用FAA固定液進(jìn)行固定，分別用蘇木精、番紅和固綠染色，然后按照標(biāo)準(zhǔn)制蠟方法制備蠟塊[6]。蠟塊制備完畢，用手動(dòng)切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚度為8 μm，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察、檢片、統(tǒng)計(jì)和拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

每次試驗(yàn)3次重復(fù)，取其平均值， 并用SPSS 13.0對(duì)突變體材料與對(duì)照之間的差異進(jìn)行t 檢驗(yàn)（P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著）。用Photoshop CS2進(jìn)行圖片的組合與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 Shuanglimi劍葉光合作用參數(shù)的變化

Shuanglimi光合作用的指標(biāo)由凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、胞間CO2濃度（Ci）、葉片氣孔導(dǎo)度（Gs）、水分利用率（WUE）和羧化效率（CE）等6個(gè)相關(guān)參數(shù)組成（表1）。從表1可以看出，Shuanglimi的Pn較CK降低（71.18±2.08）%（P<0.01），而其Gs高出CK近1倍（P<0.05）。同時(shí)，Shuanglimi的WUE和CE較CK分別降低了（71.99±2.51）%（P<0.01）和（79.33±3.27）%（P<0.01）。然而，Shuanglimi的Tr和Ci與CK之間無(wú)顯著差異。羧化效率（CE）可以反映葉片對(duì)進(jìn)入葉片細(xì)胞間隙CO2的同化狀況。羧化效率越高，說(shuō)明光合作用對(duì)CO2的利用效率越高。從上面分析來(lái)看，Shuanglimi的光合效率和羧化效率遠(yuǎn)低于CK，這可能是Shuanglimi生長(zhǎng)勢(shì)弱于CK的原因之一。

2.2 Shuanglimi葉綠素含量的變化

Shuanglimi的葉綠素含量顯著低于CK（表2），Shuanglimi 的葉綠素a、葉綠素b以及總?cè)~綠素分別較CK降低了（12.39±1.47）%（P<0.05），（95.56±2.64）%（P<0.01）和（42.13±1.83）%（P<0.05），表明Shuanglimi 的葉綠素總體降低，尤其是葉綠素b最為缺乏。然而Shuanglimi 的Chla/Chlb卻極顯著地高于CK（P<0.01），表明Shuanglimi中葉綠素主要是以葉綠素a為主，這可能是造成Shuanglimi中葉片顏色較CK明顯變淺和光合效率降低的一個(gè)主要原因。

2.3 Shuanglimi劍葉中維管束的變化

Shuanglimi劍葉橫切面中維管束的特征與CK之間有較大的差異。從圖2可以看出，在整個(gè)劍葉的橫切面中存在著大維管束和小維管束，大維管束分布在小維管束之間。在Shuanglimi中，維管束染色較淺，不易觀察，而CK中的維管束染色較深，容易觀察（圖2A、圖2B）。在劍葉的中脈由多個(gè)維管束和一些薄壁細(xì)胞組成，中間有大而分隔的空腔。Shuanglimi空腔的面積明顯小于CK，且空腔周圍的維管束數(shù)目同樣少于CK（圖2C、圖2D）。在每個(gè)大維管束中，導(dǎo)管的數(shù)目存在著一定的差異。在CK中，每個(gè)大維管束中的導(dǎo)管主要有2個(gè)，也有1個(gè)和3個(gè)導(dǎo)管出現(xiàn)（圖3A、圖3B）。然而，在Shuanglimi中，雖然每個(gè)大維管束中的導(dǎo)管還是以2個(gè)為主，但是1個(gè)、3個(gè)和4個(gè)導(dǎo)管的情形頻繁出現(xiàn)（圖3C至圖3F）。從統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（表3）來(lái)看，在整個(gè)劍葉的橫截面中，Shuanglimi和CK的大維管束數(shù)量相近，而Shuanglimi的小維管束數(shù)目較CK降低了18.86%（P<0.01）。Shuanglimi中1個(gè)導(dǎo)管的大維管束數(shù)目與CK十分接近，而其2個(gè)導(dǎo)管的大維管束數(shù)目較CK減少了17.89%（P<0.05）。同時(shí)，Shuanglimi中3個(gè)導(dǎo)管的大維管束數(shù)目較CK高出1倍多。然而，4個(gè)導(dǎo)管的大維管束在Shuanglimi中平均含有（0.333±0.018）個(gè)，而在CK中則無(wú)此種特異情況存在。

3 討論

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并研究的具有雙子房的突變體有mp1、mp2[7]、tom-1[8]、TOR[9]和PRR16[10]等。研究者發(fā)現(xiàn)mp1和mp2雄蕊數(shù)目增多，內(nèi)外稃間有2個(gè)谷粒；tom-1雙子房?jī)蓚?cè)各有一個(gè)完整外穎，內(nèi)穎退化成針狀，產(chǎn)生雙粒米種子；TOR 突變體多為融合雙子房，雄蕊數(shù)目減少，雌蕊數(shù)目增多，有雄蕊雌蕊化現(xiàn)象，穎片、漿片無(wú)變異， 個(gè)別無(wú)內(nèi)稃， 每個(gè)穎花只產(chǎn)生一粒種子， 可以認(rèn)為只發(fā)生了第3、4 輪花器官的變異；PRR16的雄蕊增多，有多余的穎片，產(chǎn)生雙粒或3粒種子。雖然上述突變體均具有雙子房性狀， 與此次報(bào)道的Shuanglimi類似， 但也存在顯著差異。水稻突變體Shuanglimi雄蕊數(shù)目少，存在雄蕊退化并直接發(fā)育成枝粳的現(xiàn)象，同時(shí)雙子房?jī)蓚?cè)各有一完整外穎，內(nèi)穎退化，它是集中了tom-1和TOR的發(fā)育特點(diǎn)。由此認(rèn)為水稻突變體Shuanglimi可能是一種新的雙子房突變體。

此次以這種新的雙子房突變體Shuanglimi為試驗(yàn)材料，研究了影響其特異發(fā)育的光合特性及與其相關(guān)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。對(duì)Shuanglimi的光合作用分析表明在幼穗進(jìn)行減數(shù)分裂期間，除Tr和Ci與CK無(wú)顯著差異外，Shuanglimi的劍葉凈光合效率、水分利用率以及羧化效率均比CK大幅度降低，而氣孔導(dǎo)度卻提高了近1倍。這說(shuō)明在蒸騰作用和胞間CO2濃度變化不大的情況下，在Shuanglimi中由于水分利用率以及羧化效率均比較低，盡管氣孔導(dǎo)度有所增加，但其凈光合速率仍然很低。這說(shuō)明Shuanglimi光合效率較弱的原因可能是由自身特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)所決定的，這也可能是Shuanglimi小穗形成過(guò)程中特異發(fā)育的一個(gè)誘因。從細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析來(lái)看，Shuanglimi光合作用比較弱的原因可能有以下兩點(diǎn)：①Shuanglimi的總?cè)~綠素含量較對(duì)照降低，尤其是葉綠素b含量大幅減少。作為光合作用主要的捕光色素，葉綠素b含量的降低直接影響了羧化效率，進(jìn)而削弱光合效率。②Shuanglimi劍葉中維管束的特異性間接影響了光合作用。與CK相比，Shuanglimi劍葉中小維管束數(shù)目減少，大維管束中3個(gè)和4個(gè)特異導(dǎo)管的出現(xiàn)縮小了單個(gè)導(dǎo)管的體積，減弱了其將根部的無(wú)機(jī)鹽、水分等向劍葉輸送的能力，降低了光合作用的水分利用率，進(jìn)而在一定程度上影響了光合效率。從光合特性和與其相關(guān)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面對(duì)Shuanglimi的生理特性進(jìn)行初步探討，可為進(jìn)一步研究其子粒特性和生殖特性奠定基礎(chǔ)，也為全面了解雙子房突變體提供了有意義的參考資料。

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