金桔紅掌離體培養(yǎng)的研究

摘 要：以金桔紅掌葉片為實驗材料，對外植體最佳消毒時間及增殖培養(yǎng)方案的優(yōu)化進行了研究。結(jié)果表明，外植體最佳消毒時間為16min；增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為3/5MS+6-BA 0.2mg/L+IBA 0.05mg/L+NAA 0.03mg/L；過渡培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS+活性炭1g/L+蔗糖35g/L。

關(guān)鍵詞：金桔紅掌；葉片；消毒時間；增殖培養(yǎng)；過渡培養(yǎng)

中圖分類號 S682 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）13-41-03

紅掌（Authurium undreanum）為天南星科花燭屬多年生常綠草本植物[1]，原產(chǎn)于中南美洲哥倫比亞西南部，是一種很好的盆花和切花植物。紅掌花葉優(yōu)美，高貴典雅，是目前國際花卉市場上流行的一種名貴花卉，成為僅次于熱帶蘭的第二大熱帶花卉商品。紅掌由法國著名植物學(xué)家Elouard Andr在1896年從哥倫比亞西南部引種到歐洲，比利時人Jean Linden率先栽培并開始銷售，從此便作為商品開始風靡全球。但由于紅掌用常規(guī)分株繁殖難以擴大生產(chǎn)，而播種繁殖要經(jīng)人工授粉才能獲得種子，耗費人力，所以組織培養(yǎng)成為紅掌快速繁殖的唯一途徑。自Pierik[2]于1974年對紅掌進行組織培養(yǎng)取得成功以來，國內(nèi)外學(xué)者對其進行了大量的組織培養(yǎng)的研究，但絕大多數(shù)的研究僅限于某一品種或單一器官（莖尖研究最多）。1986年Keller等研究用MS. skoog培養(yǎng)基作葉插（加KT 2mg/L），1～2個月可形成愈傷組織。1990年，Lightboarn等報道0.5mg/L的2，4-D對愈傷組織的誘導(dǎo)效果最好，增加NH4NO3濃度可使葉片愈傷組織增殖加快。1999年，Kuehrle-A等用4種雜交種幼苗的葉進行組培，發(fā)現(xiàn)在暗培養(yǎng)1個月后有半透明的胚胎發(fā)生。23個月后，用MS+6-BA 0.2mg/L+2.0%蔗糖繼代培養(yǎng)，成苗后移入溫室。1993年，復(fù)旦大學(xué)研究表明[3]，在幼苗微培養(yǎng)中，晝長夜短可誘導(dǎo)愈傷組織生長；3.0%葡萄糖對愈傷組織形成是最有效的。我國從1998年開始研究[4]，現(xiàn)已成功掌握了植株再生體系的建立、繼代增殖培養(yǎng)、壯苗和生根培養(yǎng)、移栽和溫室育苗等技術(shù)。研究人員通過采用不同的器官作為外植體，對不同培養(yǎng)基進行篩選比較，總結(jié)出一套較為完整的操作流程。不同的品種培養(yǎng)技術(shù)會有差異，在不斷引進新品種的同時研究其組織培養(yǎng)技術(shù)具有現(xiàn)實意義。

金桔紅掌（Anthurium Golden Orange）為天南星科花燭屬，葉寬橢圓狀心臟形，全緣，綠色，是從紅掌變異品種中經(jīng)過選育而成的具有觀賞潛力的新品種。筆者以金桔紅掌為原材料，對外植體最佳消毒時間及增殖培養(yǎng)方案的優(yōu)化進行了研究，其目的是降低污染率，從而提高金桔紅掌的成活率以及金桔紅掌的增殖倍率，對金桔紅掌的離體培養(yǎng)有重要意義，也為以后紅掌新品種的選育作一個參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 實驗于2012年春在廣東華力園藝有限公司實驗基地進行。材料為金桔紅掌葉片，金桔紅掌從該公司華倫天奴品種中選出。株高31.8cm，葉寬橢圓狀心臟形，全緣，綠色?；ü娜~腋處抽生，佛焰苞苞片長6.9cm，寬7.2cm，苞片顏色前期為桔紅色，頂部帶綠色?；ㄐ蜷L4.8cm，粗為1cm，花序初為桔黃色，后為下白上桔紅，之后逐漸變?yōu)榫G色。花梗長31.3cm，桔紅色至暗紅色。

1.2 方法

1.2.1 金桔紅掌外植體消毒時間試驗 選擇好的母株置于干凈、通風良好的溫室中，整個處理過程中不施肥、不澆水，處理后植株呈萎蔫狀態(tài)，基質(zhì)土壤不濕潤、不沾手即可做種。選擇無病蟲害植株的葉片，在預(yù)處理室通過精心處理之后用0.05%洗衣粉溶液清洗3～5min，然后帶回接種室，再用1‰的升汞溶液分別消毒12、16、18min，消毒完畢后用無菌水清洗3～5遍，切下葉片四周升汞侵蝕部位，接種于培養(yǎng)基中。外植體為金桔葉片，每個處理16片；誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS，pH值6.0；La（卡拉膠）5.5g/L；蔗糖30g/L。培養(yǎng)條件：光照強度1 500lx左右，光照時間12±0.5h/d，溫度26±1℃，培養(yǎng)周期為6周（圖1）。

<＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農(nóng)學(xué)通報雜志＼農(nóng)學(xué)通報2013-13＼3823-1-4.tif><＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農(nóng)學(xué)通報雜志＼農(nóng)學(xué)通報2013-13＼3823-1-1.tif><＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農(nóng)學(xué)通報雜志＼農(nóng)學(xué)通報2013-13＼3823-1-2.tif><＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農(nóng)學(xué)通報雜志＼農(nóng)學(xué)通報2013-13＼3823-1-3.tif>[母本圖片][外植體][初代愈傷長勢][初代切割后]

圖1 實驗材料

在培養(yǎng)6周后，觀測真菌污染數(shù)、細菌污染數(shù)，計算真菌污染率、細菌污染率及成活率，計算方法為：真菌污染率（%）=真菌污染數(shù)/接種總數(shù)×100，細菌污染率（%）=細菌污染數(shù)/接種總數(shù)×100，成活率（%）=成活數(shù)/接種總數(shù)×100。

1.2.2 金桔紅掌芽的增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選 選擇經(jīng)過31周繼代培養(yǎng)的生長良好的健康金桔紅掌苗作為實驗材料，在超凈工作臺上進行接種，其接種操作方法為：按方向性切割，2～3芽/團，芽高5～15mm或愈傷團塊直徑6～10mm；單芽高度超過15mm，從基部切下置于團塊旁增殖；剔除根、黃化葉及死亡組織；去除扭曲、拔節(jié)芽，置于培養(yǎng)基中。分別用A、B、C、D、E 5種培養(yǎng)基做增殖培養(yǎng)（見表1），進行比較。培養(yǎng)條件為：光強1 500lx左右，光照時間14h/d，溫度26±1℃（圖2）。

表1 金桔紅掌的增殖培養(yǎng)基

[處理＼增殖培養(yǎng)基＼A＼1/2 MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.03mg/L＼B＼1/2 MS+6-BA 0.2mg/L+IBA 0.05mg/L+NAA 0.03mg/L＼C＼3/5 MS+6-BA 0.2mg/L+IBA 0.05mg/L+NAA 0.03mg/L＼D＼3/5 MS+6-BA 0.3mg/L+IBA 0.05mg/L+NAA 0.03mg/L＼E＼1/2 MS+6-BA 1.Omg/L+IBA 0.5mg/L＼]

<＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農(nóng)學(xué)通報雜志＼農(nóng)學(xué)通報2013-13＼3823-2-5.tif><＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農(nóng)學(xué)通報雜志＼農(nóng)學(xué)通報2013-13＼3823-2-1.tif><＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農(nóng)學(xué)通報雜志＼農(nóng)學(xué)通報2013-13＼3823-2-2.tif><＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農(nóng)學(xué)通報雜志＼農(nóng)學(xué)通報2013-13＼3823-2-3.tif><＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農(nóng)學(xué)通報雜志＼農(nóng)學(xué)通報2013-13＼3823-2-4.tif>

圖2 增殖圖片

在培養(yǎng)30d后，觀測增殖系數(shù)，計算方法為：增殖系數(shù)=材料切割后團塊數(shù)/未切割前團塊數(shù)。

1.2.3 金桔紅掌芽的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選 選擇經(jīng)過31周繼代培養(yǎng)的生長良好的健康金桔紅掌苗作為實驗材料，進行過渡培養(yǎng)，過渡培養(yǎng)的目的是為了減少苗的污染和變異，同時提高生根系數(shù)，增加產(chǎn)量。過渡的接種操作方法為：選擇無病毒無變異的苗，進行方向性切割，每2～3芽/團，無需去頂，切除多余的基部，置于培養(yǎng)基中。過渡培養(yǎng)選擇A、B、C、D 4種培養(yǎng)基（見表2）進行比較。培養(yǎng)條件為光強1 500～2 000lx，時間12～14h/d，溫度25±1℃（圖3）。

表2 金桔紅掌的生根培養(yǎng)基

[處理＼生根培養(yǎng)基＼A＼MS+活性炭1g/L+蔗糖30g/L＼B＼MS+活性炭1g/L+蔗糖35g/L＼C＼MS+活性炭1g/L+蔗糖40g/L＼D＼MS+NAA 3mg/L+IBA 1mg/L+活性炭1g/L+蔗糖40g/L ＼]

<＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農(nóng)學(xué)通報雜志＼農(nóng)學(xué)通報2013-13＼3823-3-1.tif><＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農(nóng)學(xué)通報雜志＼農(nóng)學(xué)通報2013-13＼3823-3-2.tif><＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農(nóng)學(xué)通報雜志＼農(nóng)學(xué)通報2013-13＼3823-3-3.tif><＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農(nóng)學(xué)通報雜志＼農(nóng)學(xué)通報2013-13＼3823-3-4.tif>

圖3 過渡試驗圖片

在培養(yǎng)30d后，觀測生根系數(shù)，生根系數(shù)=已生根團塊數(shù)/所用材料總團塊數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時間對外植體培養(yǎng)的影響 不同消毒時間對金桔紅掌原種制作的影響見表3。金桔紅掌外植體總成活率26.53%，總真菌污染為24.48%，總死亡率48.97%。在消毒時間為12min時，真菌污染最多，消毒時間為18min時出現(xiàn)死亡的最多，只有在消毒時間為16min時，外植體的成活率最高。實驗結(jié)果表明，消毒時間過短，則消毒不徹底導(dǎo)致真菌污染嚴重，影響外植體成活率；消毒時間過長則增加外植體死亡率。所以，選擇外植體消毒時間為16min最適合。

表3 不同消毒時間對金桔紅掌組織培養(yǎng)的影響

[處理

（min）＼外植體數(shù)量

（個）＼真菌污染率

（%）＼細菌污染率

（%）＼死亡率（%）＼成活率

（%）＼12＼16＼7.3＼0＼7.3＼3.2＼16＼16＼1.2＼0＼6.2＼7.1＼18＼16＼4.6＼0＼11.4＼3.5＼]

2.2 不同培養(yǎng)基對金桔紅掌增殖培養(yǎng)的影響 由表4看出，比較培養(yǎng)基A和B，培養(yǎng)基B中添加了IBA 0.05mg/L，增殖系數(shù)增加了0.11。由此可知，添加IBA有利于增殖系數(shù)的提高。培養(yǎng)基C和D中，只有6-BA的濃度有所不同，濃度高的其增殖系數(shù)低一些。比較培養(yǎng)基A、B、C、D、E可以看出，培養(yǎng)基E中，激素6-BA、IBA結(jié)合利于增殖系數(shù)的提高，并使增殖系數(shù)達到最大值；然而，6-BA、IBA、NAA結(jié)（下轉(zhuǎn)157頁）（上接42頁）合更有利于材料生長，而且株型較好，葉片展開度也較佳。綜合得出，培養(yǎng)基3/5MS+6-BA 0.2mg/L+IBA 0.05mg/L+NAA 0.03mg/L最佳，若只用于增殖生產(chǎn)，使用培養(yǎng)基1/2MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L最佳。

表4 不同培養(yǎng)基對金桔紅掌增殖培養(yǎng)的影響

[處理＼外植體數(shù)量（個）＼增殖系數(shù)＼生長情況＼A＼120＼1.96＼芽壯、根多＼B＼120＼2.07＼根多、芽長勢一般＼C＼120＼2.34＼根多，芽比較壯＼D＼120＼2.15＼芽壯、有根，長勢較好＼E＼120＼3.05＼根少、芽點多、抽起的芽少＼]

2.3 不同培養(yǎng)基對金桔紅掌生根培養(yǎng)的影響 由表5可以看出，A、B、C 3種培養(yǎng)基只有蔗糖濃度有差異，通過比較三者的生根系數(shù)可知，在培養(yǎng)基中蔗糖濃度過低、過高均會降低生根系數(shù)，尤其是當蔗糖濃度過高時還會出現(xiàn)苗生長不太正常的現(xiàn)象。培養(yǎng)基C和D比較，D的生根系數(shù)要高，可見在培養(yǎng)基中添加適當?shù)募に貢岣呱禂?shù)。比較4種培養(yǎng)基可知，以培養(yǎng)基B（MS+活性炭1g/L+蔗糖35g/L）的生根系數(shù)最高，長勢最好。

表5 不同培養(yǎng)基對金桔紅掌生根培養(yǎng)中生根系數(shù)和生長的影響

[處理＼原材料（團）＼生根系數(shù)＼生長情況＼A＼120＼0.76＼長勢正常＼B＼120＼0.81＼長勢好、葉寬正常＼C＼120＼0.70＼葉寬偏?。蹹＼120＼0.73＼長勢一般＼]

3 結(jié)論與討論

作為時尚盆花和切花的紅掌，越來越受到人們的喜愛和重視，組織培養(yǎng)是紅掌繁殖的重要方法，其中，通過外植體獲得愈傷組織是紅掌組培快繁的關(guān)鍵步驟，愈傷組織誘導(dǎo)成功與否與外植體的取材部位、消毒方法、誘導(dǎo)培養(yǎng)基都有密切關(guān)系[5]。

金桔紅掌葉片組織培養(yǎng)中，由于培養(yǎng)器皿、培養(yǎng)基、培養(yǎng)材料、操作器械等消毒不徹底，或者操作不謹慎、接種環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境不清潔等因素引起細菌以及真菌的污染。避免污染的主要方法是外植體的消毒，消毒時間短，污染率就高；消毒時間長，易殺死外植體[6-7]。合理控制消毒時間是獲得紅掌組培苗的關(guān)鍵。本實驗中，隨著消毒時間的延長，紅掌的成活率呈上升趨勢，污染率逐漸下降。但消毒時間過長，則使外植體出現(xiàn)死亡。所以金桔紅掌選擇外植體消毒時間為16min最適合。

大多數(shù)有關(guān)紅掌組織培養(yǎng)的研究側(cè)重于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇。本研究表明，激素IBA、NAA結(jié)合對材料生根系數(shù)影響不大，這與趙衛(wèi)國等的研究不同。趙衛(wèi)國[8]等的研究表明NAA可以促進紅掌提早生根，且產(chǎn)生的根系粗壯，但是根系短，根毛多且根為黃色；添加適量糖有利于材料生長，本研究也得出與之相似的結(jié)果。綜合來看，在4種優(yōu)選的培養(yǎng)基中，金桔紅掌過渡培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基是MS+活性炭1g/L+蔗糖35g/L。

芽分化和增殖是影響紅掌快繁效率的主要因素。夏時云等[9]研究發(fā)現(xiàn)，BA是影響愈傷組織芽分化最重要的激素。另有研究表明，愈傷組織芽分化往往是多種激素相互平衡及協(xié)同作用的結(jié)果，激素配比尤為重要[10]。一般認為，細胞分裂素和生長素的比例是影響增殖系數(shù)和不定芽質(zhì)量的主要因素[11-12]。在紅掌不定芽誘導(dǎo)分化過程中，IBA是適合紅掌不定芽誘導(dǎo)的生長素，對不定芽的誘導(dǎo)效果優(yōu)于NAA。因此實驗結(jié)果表明，培養(yǎng)基3/5MS+6-BA 0.2mg/L+IBA 0.05mg/L+NAA 0.03mg/L是金桔紅掌增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。

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