鐵皮石斛莖段組織培養(yǎng)技術研究

摘 要：以鐵皮石斛叢生芽作為外植體，通過研究影響鐵皮石斛生長的主要因素，篩選鐵皮石斛莖段組培快繁的適宜培養(yǎng)基，總結實用的快繁方法。結果表明，以MS培養(yǎng)基+6-BA 0.5mg/L+ NAA 0.2mg/L+30g/L糖+6.5g/L瓊脂+0.5g/L活性炭，添加10%的香蕉泥作為天然附加物，pH值5.8，是鐵皮石斛叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基；以MS+IBA 1.5mg/L+NAA 1.5mg/L為鐵皮石斛生根誘導的最佳培養(yǎng)基。通過實驗總結出鐵皮石斛莖段組培快繁技術，為鐵皮石斛的資源保護和應用推廣提供重要的科學依據(jù)。

關鍵詞：鐵皮石斛；組織繁殖；增殖分化；壯苗生根

中圖分類號 S567.239 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）13-32-03

Study on Tissue Culture Techniques for Stem Segment of Dendrobium officinale

Qi Huasha et al.

（Garden Flower Research Institute of Hainan Academy of Agricultural Sciences，Haikou 571100，China）

Abstract：The regeneration methods of bud clumps was adopted to establish a rapid technique system of propagation in Dendrobium officinale in this experiment. The result showed that the best multiplication medium is MS+ 6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+30g/L sugar+6.5g/L agar+0.5g/L activated carbon，add 10% banana mud，pH5.8.And MS+IBA 1.5mg/L+NAA 1.5mg/L for the best rooting medium of Dendrobium candidum. This techniques of tissue culture for Dendrobium officinale provided an important scientific basis for resource protection and application.

Key words：Dendrobium officinale；Tissue culture；Proliferation；Rooting

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為蘭科多年生附生草本植物，長于海拔達1 600m的山地半陰濕的巖石上，并常與苔蘚植物伴生，喜溫暖濕潤氣候和半陰半陽的環(huán)境，一般在-5℃以下的低溫停止生長[1-2]。鐵皮石斛具有極高的藥用價值和經(jīng)濟價值，其新鮮莖或干燥莖均可入藥，是我國最常用傳統(tǒng)藥材與中成藥的原料藥。其味甘淡，性微寒，用于治療陰傷津虧，口干煩渴，食少干嘔，病后虛弱，目暗不明等癥，為中國十大仙草之一?，F(xiàn)代藥理研究表明，鐵皮石斛具有降血糖、增強抵抗力的功效[3]。由于生長條件特殊和分布局限，以及長期采挖，鐵皮石斛的自然資源瀕臨枯竭，供應緊缺，目前鐵皮石斛已被列為國家重點保護藥用植物、中國珍稀瀕危二級保護植物和世界二類保護植物[4]。鐵皮石斛自然繁殖率很低，采用傳統(tǒng)的分株繁殖法，繁殖速度比較慢，且植株生長不一致，抗病蟲害能力差[5]，利用組培快繁技術繁殖試管苗，不僅是解決鐵皮石斛野生資源緊缺的有效方法，也對該物種的種質(zhì)資源保護起到積極的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 本實驗用的鐵皮石斛采自于海南省五指山市五指山山上，采回后栽種在海南省農(nóng)業(yè)科學院蘭圃實驗園用于實驗。

1.2 方法

1.2.1 滅菌及接種方法 選擇生長旺盛、無病害的鐵皮石斛健康植株，用刀片切取長為3～5cm的頂芽，剝?nèi)ス?jié)上葉片，放置于洗潔精溶液中搖蕩2min，再用自來水沖洗；瀝干水后，在超凈工作臺上，先用75%的乙醇浸泡15s，無菌水沖洗3次，再用0.1%升汞浸泡14min，用無菌水沖洗5次。每次取一塊莖段，切除兩邊頂端，將莖段放置誘導培養(yǎng)基上，誘導分化產(chǎn)生叢生芽，取叢生芽做以下實驗。

1.2.2 培養(yǎng)條件 本實驗的各個培養(yǎng)階段中，培養(yǎng)物均置于培養(yǎng)光照強度為1 500～2 000lx日光燈照明條件下，培養(yǎng)溫度為25℃，每天光照10～12h[6]。

1.2.3 培養(yǎng)基配制方法 本實驗中所采用的各種培養(yǎng)基均按照植物培養(yǎng)的常規(guī)方法配制和滅菌。

1.3 試驗設計

1.3.1 不同濃度的6-BA+NAA0.2mg/L對鐵皮石斛叢生芽增殖的影響 本試驗在MS基本培養(yǎng)基中分別添加6-BA0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/L和NAA0.2mg/L，選取長勢一致的叢生芽接入上述7種培養(yǎng)基，每個處理20袋，每袋8株，即每個處理160株，50d統(tǒng)計增殖系數(shù)，觀察生長狀況。

1.3.2 天然附加物對鐵皮石斛叢生芽增殖的影響 在MS基本培養(yǎng)基中分別加入椰子水、香蕉泥、馬鈴薯泥（香蕉泥用新鮮果實打漿而成，馬鈴薯泥用新鮮塊莖去皮打漿而成）各10%，切取叢生芽接種到繼代培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，每個處理20袋，每袋8株，即每個處理160株，50d統(tǒng)計增殖系數(shù)，觀察生長狀況。

1.3.3 不同濃度的活性炭對鐵皮石斛叢生芽的增殖影響 本實驗在MS+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+10%香蕉泥的基本培養(yǎng)基中分別添加0.3g/L、0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L的活性炭，選取長勢一致的叢生芽接入上述5種培養(yǎng)基及對照組，每個處理20袋，每袋8株，即每個處理160株，50d統(tǒng)計增殖系數(shù)，觀察生長狀況。

1.3.4 不同生長素對鐵皮石斛生根誘導的影響 以植株高達2～3cm的無根袋苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上作為生根培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。選擇不同配比濃度的兩種生長素作為鐵皮石斛生根培養(yǎng)影響的研究，篩選出適宜鐵皮石斛生根壯苗的培養(yǎng)基。根據(jù)分化增殖培養(yǎng)基對鐵皮石斛的影響，設置以下10種配比濃度誘導生根（見表4）。將叢生苗切成無根單株轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，每個處理40袋，每袋8株，即每個處理320株，培養(yǎng)50d統(tǒng)計生根生長狀況。

2.1 不同濃度6-BA+NAA0.2mg/L對鐵皮石斛叢生芽增殖的影響 不同濃度的6-BA+NAA0.2mg/L對鐵皮石斛叢生芽的影響不盡相同，中小苗接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)15d后均開始長出新芽，25d后芽增長明顯，培養(yǎng)50d的生長情況見表1。其中以0.5mg/L的增殖效果最好，增殖系數(shù)達4.72倍，生長狀況為長勢好，植株健壯，種苗多，高達3.2cm；濃度0.5～3.0mg/L的范圍內(nèi)，隨著6-BA濃度的增加，叢生芽增殖系數(shù)逐漸的減少，增殖系數(shù)維持在一個較高的水平上波動（波動范圍在1.70～4.72倍）。可見，高質(zhì)量濃度的6-BA對鐵皮石斛叢生芽增殖有一定的抑制作用，因此比較合適鐵皮石斛叢生芽增殖培養(yǎng)基為：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L。

表1 不同濃度的6-BA+NAA0.2mg/L對鐵皮石斛

叢生芽增殖的影響

[6-BA的濃度（mg/L）＼起始芽

數(shù)（株）＼增殖后芽數(shù)（株）＼增殖系數(shù)（倍）＼生長狀況＼0.1＼160＼568＼3.55＼長勢好，植株健壯，苗多，種苗高達3.2cm＼0.5＼160＼755＼4.72＼長勢好，植株健壯，苗多，種苗高達3.5cm＼1.0＼160＼526＼3.29＼長勢好，植株健壯，種苗高達2.9cm＼1.5＼160＼496＼3.10＼長勢一般，種苗高達2.5cm＼2.0＼160＼345＼2.16＼長勢一般，種苗高達2.2cm＼2.5＼160＼302＼1.89＼長勢弱，種苗高為0.5～1.5cm＼3.0＼160＼272＼1.70＼長勢弱，芽細＼]

2.2 天然附加物對鐵皮石斛叢生芽增殖的影響 培養(yǎng)基：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L加入3種10%天然附加物對鐵皮石斛叢生芽的增殖系數(shù)有明顯的影響（見表2），其中椰子水對鐵皮石斛叢生芽的增殖促進作用最大，增殖倍數(shù)達到4.82倍，其次是香蕉泥，增殖系數(shù)達到4.74倍，第三為馬鈴薯泥，增殖系數(shù)達到3.92倍。添加3種天然附加物相對于ck表現(xiàn)為粗壯，葉色濃綠，生長整齊，并且增殖系數(shù)較高，所以3種有機附加物對鐵皮石斛叢生芽的分化有促進作用。而ck和馬鈴薯泥在培養(yǎng)后期均會出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，需要及時轉(zhuǎn)瓶，因此，在生產(chǎn)鐵皮石斛種苗時以香蕉及椰子水作為添加物為宜。

表2 不同天然附加物對鐵皮石斛叢生芽增殖的影響

[天然附加

物種類＼起始芽數(shù)

（株）＼增殖后芽數(shù)

（株）＼增殖系數(shù)

（倍）＼生長狀況＼ck＼160＼323＼2.02＼芽苗細弱，輕微的玻璃化＼椰子水＼160＼771＼4.82＼芽苗正常，且整齊健壯，綠色＼馬鈴薯泥＼160＼627＼3.92＼芽苗正常，綠色＼香蕉泥＼160＼758＼4.74＼芽苗健壯，深綠色＼]

2.3 不同濃度活性炭對鐵皮石斛叢生芽的增殖影響 培養(yǎng)基：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+10%香蕉泥，加入不同濃度的活性炭對鐵皮石斛叢生芽增殖系數(shù)的影響見表3，其中0.5g/L的活性炭對鐵皮石斛叢生芽的增殖促進作用最大，增殖系數(shù)達到4.83倍，其次是1.0g/L的活性炭，增殖系數(shù)達到4.81倍，在不加活性炭的培養(yǎng)基中叢生芽的增殖系數(shù)最低，為3.90倍，而且芽苗長勢差，苗不整齊，部分還出現(xiàn)葉片枯黃現(xiàn)象，而在添加不同濃度活性炭的所有培養(yǎng)基中，叢生芽分化多，葉綠，增殖系數(shù)均高于不加活性炭的處理。結果表明，1.0g/L及0.5g/L的活性炭濃度，叢生芽增殖系比較高；濃度0.5～2.0g/L的范圍內(nèi)，隨著活性炭濃度的增加，叢生芽增殖系數(shù)依次減少，但活性炭濃度的影響維持在一個較小的水平上波動（波動范圍在4.83～4.75倍），差別不是很明顯。因此，鐵皮石斛叢生芽的繼代增殖培養(yǎng)以選擇低濃度的活性炭為宜，即0.5g/L。

表3 不同濃度活性炭對鐵皮石斛叢生芽的增殖影響

[活性炭濃度

（g/L）＼起始芽數(shù)

（株）＼增殖后芽數(shù)

（株）＼增殖系數(shù)

（倍）＼生長狀況＼0＼160＼ 624＼3.90＼長勢差，苗不整齊，

部分葉枯黃＼0.3＼160＼768＼4.80＼芽苗正常，綠色＼0.5＼160＼772＼4.83＼芽苗正常，綠色＼1.0＼160＼769＼4.81＼芽苗正常，綠色＼1.5＼160＼761＼4.76＼芽苗正常，綠色＼2.0＼160＼760＼4.75＼芽苗正常，綠色＼]

2.4 不同濃度的兩種生長素對鐵皮石斛根系發(fā)育的影響 試驗不同濃度的IBA和NAA兩種生長素對鐵皮石斛生根壯苗的影響，二者分別設定了不同的濃度交叉處理（見表4）。不同生長素對鐵皮石斛生根發(fā)育有明顯的影響，其中以IBA1.5mg/L+NAA1.5mg/L處理的效果最明顯，其平均根數(shù)達4.5條/株，平均每株的根長為2.65cm，而且根系粗壯，較發(fā)達；IBA0.1mg/L+NAA2.0mg/L處理的效果次之，平均根數(shù)達4.2條/株，平均每株的根長為2.45cm，根粗長，苗壯；添加2種生長素對鐵皮石斛的生根都有促進作用，不加生長素表現(xiàn)為苗弱，根細，根短，根數(shù)少；各濃度處理組平均根數(shù)、根長、株高的影響效果均呈拋物線分布。上述數(shù)據(jù)表明，能使無菌苗生根效果好的培養(yǎng)基配方為IBA1.5mg/L+NAA1.5mg/L及IBA0.1mg/L+NAA2.0mg/L，生長的根粗細均勻，根多，平均根數(shù)為4.2～4.5根/株，根長2.45～3.65cm，株高3.8cm以上，苗壯，有利于煉苗移栽。

表4 不同濃度的兩種生長素對鐵皮石斛生根誘導的影響

[IBA的濃度

（mg/L）＼NAA的濃度

（mg/L）＼平均根數(shù)

（條/株）＼平均根長

（cm）＼株高

（cm）＼生長狀況＼0＼0＼1.92＼1.08＼2.34＼苗弱，根細，根短＼0.1＼0.1＼2.66＼1.21＼3.03＼根少，且短＼0.5＼0.5＼3.12＼1.42＼3.59＼根少，略長些＼1.0＼1.0＼3.20＼2.02＼3.78＼粗細正常＼1.5＼1.5＼4.50＼2.65＼3.86＼根較粗，生長較快＼2.0＼2.0＼3.62＼2.68＼3.89＼根粗長，苗壯＼0.1＼2.0＼4.20＼2.45＼3.80＼根粗長，苗壯＼0.5＼1.5＼4.01＼2.65＼3.67＼根粗長，根長＼1.0＼1.0＼3.90＼2.11＼3.00＼根粗短，根多＼1.5＼0.5＼3.11＼2.01＼2.98＼根少且短，苗?。?.0＼0.1＼2.90＼1.98＼2.95＼根少且短，植株瘦弱＼]

3 結論與討論

3.1 關于多個因子對鐵皮石斛叢生芽增殖的影響 鐵皮石斛是一種附生植物，在組織培養(yǎng)工作中，注意調(diào)整它的營養(yǎng)成分，滿足其生長分化增殖，是該植物組織培養(yǎng)成功的關鍵所在。本試驗通過不同濃度的6-BA+NAA0.2mg/L對鐵皮石斛不定芽增殖的影響，篩選6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L培養(yǎng)基是適合于鐵皮石斛生長分化增殖的基本培養(yǎng)基，它具有營養(yǎng)全面、激素適中、生長良好等優(yōu)點。通過對3種天然附加物+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L對鐵皮石斛芽增殖率有明顯的影響試驗表明，椰子水對鐵皮石斛芽的增殖促進作用最大，增殖系數(shù)達到4.82倍，其次是香蕉泥，再次是馬鈴薯泥，但馬鈴薯易黃化，而椰子水相較于其它的天然附加物成本高，所以香蕉泥對鐵皮石斛叢生芽增殖比較合適工廠化，可以作為今后商業(yè)化開發(fā)的重要依據(jù)。

3.2 關于調(diào)節(jié)復合生長素對鐵皮石斛生根發(fā)育的影響 本試驗中，采用不同生長素對鐵皮石斛生根誘導的影響組合研究，彌補了以前單一生長素的一些缺陷，如：單一的NAA會使培養(yǎng)植物莖稈粗壯，節(jié)間短；單一的IBA會使培養(yǎng)植物莖稈細長，不太健康[7]。調(diào)節(jié)復合生長素比例可以收到較為理想的效果。鐵皮石斛通過組織培養(yǎng)方法可以獲得大量再生植株，從根本上解決了這一寶貴資源的挽救工作難題，在條件允許的情況下，建立保護地，采用人工栽培，可使鐵皮石斛得到高效的開發(fā)利用。

3.3 展望 近年來，關于鐵皮石斛組織培養(yǎng)與離體快繁的研究工作已取得一定的進展。建立穩(wěn)定有效的組培快繁體系，不僅為鐵皮石斛大規(guī)模的人工栽培提供了大量的種苗，從而滿足市場對石斛藥材資源的需求，還可以增加鐵皮石斛的種群數(shù)量，改善其瀕危現(xiàn)狀，對鐵皮石斛的種質(zhì)資源保護和可持續(xù)利用提供了科學依據(jù)。但目前多數(shù)研究側重于原球莖的誘導與增殖、叢生芽的誘導、分化與增殖以及生根培養(yǎng)等方面，而對再生植株人工栽培的優(yōu)化研究較少，有待進一步的研究[8-9]。組培快繁技術是解決鐵皮石斛野生資源緊缺和保護鐵皮石斛種質(zhì)資源的有效途徑。如果在此基礎上結合植物細胞培養(yǎng)技術，實現(xiàn)對有效藥物成分的生產(chǎn)、分離純化以及收集利用，無疑可以增加經(jīng)濟效益。

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