三聚氰胺人工抗原的合成及初步鑒定

摘 要：采用碳化二亞胺法將三聚氰胺偶聯(lián)到牛血清白蛋白上合成免疫原三聚氰胺-牛血清白蛋白。合成的抗原進(jìn)行紫外掃描鑒定，利用辣根過(guò)氧化物酶合成HRP-MEL-BSA酶標(biāo)抗原，利用固相抗體酶標(biāo)抗原來(lái)進(jìn)行效價(jià)的測(cè)定，檢測(cè)抗原的合成。

關(guān)鍵詞：三聚氰胺；人工抗原；ELISA

中圖分類號(hào) S13 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2013）10-19-03

三聚氰胺（Melamine），IUPAC命名為“1，3，5-三嗪-2，4，6-三氨基”，化學(xué)式為C3H6N6[1]。18世紀(jì)以來(lái)，三聚氰胺已經(jīng)被作為一種重要的工業(yè)原材料在使用，因其含氮量高被作為莊稼的肥料[2]，被作為耐火材料添加到油漆、塑料盒紙張、建筑中[3，4]。從其化學(xué)式看出15個(gè)原子中，含有6個(gè)氮原子，氮含量達(dá)66.67%左右[5]，常被作為偽劣的高蛋白摻雜在牛奶、食品、飼料中[6，7]，造成蛋白質(zhì)含量虛高的假象[8]。本實(shí)驗(yàn)主要合成具有活性的三聚氰胺人工抗原，用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了三聚氰胺人工抗原合成成功，旨在為制備三聚氰胺抗體和三聚氰胺ELISA試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 三聚氰胺，純度99.5%，購(gòu)于天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；牛血清白蛋白，購(gòu)買于廈門市科展；三聚氰胺抗體，本實(shí)驗(yàn)室之前已合成。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 KHB ST-360酶標(biāo)儀，上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司制造；離心機(jī)，法國(guó)thermo tlectron industries sas 制造；KQ-500DE數(shù)控超聲波，舒美昆山市超聲儀器有限公司；UVmini-1240紫外可見分光光度計(jì)。

1.2 三聚氰胺人工抗原的合成 參照董國(guó)偉等的文獻(xiàn)[9]準(zhǔn)確稱取10mg（0.07mmol）三聚氰胺（MEL）、150mg（0.002mmol）牛血清白蛋白（BSA）、50mg的EDC，分別溶于1mL丙三醇、3mL和3mL PBS中，漩渦混勻。4℃冰浴下避光攪拌反應(yīng)4h，再向混合溶液中滴加剩下的1mL EDC溶液，繼續(xù)冰浴下反應(yīng)24h，以4 000r/min離心3min取上清液裝入透析袋，于0.01mol/L、pH7.4的PBS中4℃定時(shí)透析3d，留部分進(jìn)行鑒定，試管分裝并進(jìn)行冷凍真空干燥，合成物于-20℃條件下冷凍保存。

1.3 人工抗原結(jié)構(gòu)鑒定 在本實(shí)驗(yàn)紫外測(cè)試OD值的范圍內(nèi)，確定3種物質(zhì)濃度的條件下，三聚氰胺和牛血清白蛋白均有各自不同的紫外特征吸收峰。根據(jù)比爾定律可知，物質(zhì)對(duì)光的吸收即OD值與該物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系可推算出偶聯(lián)比計(jì)算公式如下[10]：

偶聯(lián)比=[（OD偶-OD載）×ρ半抗原×M載OD半抗原×M半抗原×ρ載×ρ偶] （1）

1.4 酶標(biāo)抗原的合成

1.4.1 過(guò)碘酸鈉法合成三聚氰胺酶標(biāo)抗原 將10mg辣根過(guò)氧化物酶（HRP）溶于2mL超純水，滴加0.4mL新配的0.1mol/L NaIO4，漩渦混勻。滴加0.4mL新配的0.2mol/L乙二醇，漩渦混勻。用0.001mol/L、pH4.4醋酸鈉緩沖液4℃透析9h，恢復(fù)室溫混勻，將活化的HRP溶液逐滴加到用2mL CBS包被液溶解的冷凍干燥的5mg MEL-BSA溶液中。室溫避光磁力攪拌30min，用2mol/L NaOH調(diào)pH值到 9.5，避光攪拌1h。加入0.2mL用超純水新配的4mg/mL NaBH4，4℃反應(yīng)2h。用PBS充分透析，于-20℃下分裝進(jìn)行保存[11]。

1.4.2 戊二醛交聯(lián)法 將10mg HRP溶于0.2mL含1.25%戊二醛的pH6.8、0.1mol/L PBS中，放置室溫18h，充分透析，記錄時(shí)間，以除去多余的戊二醛。加生理鹽水至1mL然后加5mg純化的抗原及其0.1mL、pH9.6的1mol/L碳酸鹽緩沖液，混合于4℃冰箱放置24h，加入0.1mL、0.2mol/L賴氨酸溶液，室溫放置2h。用PBS充分透析，離心除沉淀，上清即為酶結(jié)合物。

1.5 紫外鑒定 將MEL-BSA-HRP、HRP、MEL-BSA均用PBS配成0.5mg/mL的溶液，用PBS調(diào)零，在200～500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描吸收曲線并且加以比較。

1.6 直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法鑒定人工抗原及酶標(biāo)抗原合成 第一步包被抗體： 用0.05mol/L、pH9.6碳酸鹽緩沖溶液（簡(jiǎn)稱CBS）稀釋抗體稀釋成不同濃度，用移液槍滴加酶標(biāo)板上，37℃包被2h。第二步封閉：取出將包被好的酶標(biāo)板，待其恢復(fù)至室溫后，用洗滌緩沖液洗滌。加1%BSA-PBS 300μL/每孔封閉，置于37℃水浴恒溫箱中溫育30min，也可以室溫避光封閉1h，必須嚴(yán)格控制封閉時(shí)間。第三步酶標(biāo)抗原： 將封閉好的酶標(biāo)板取出，待其恢復(fù)至室溫后，甩去包被液，用洗滌緩沖溶液洗滌后，依次加入用PBS稀釋的酶標(biāo)抗原（從100倍起，對(duì)倍稀釋）100μL/孔，每個(gè)濃度重復(fù)3孔，以PBST為空白對(duì)照，置于37℃水浴恒溫箱中溫育1h。第四步加底物： 將加入酶標(biāo)抗體的酶標(biāo)板取出，待其恢復(fù)至室溫，用洗滌緩沖溶液洗滌后，加TMB液100μL/孔，置于37℃恒溫箱中15min。現(xiàn)象由無(wú)色變?yōu)樗{(lán)色。第五步終止反應(yīng)： 取出酶標(biāo)板，直接加入2mol/L硫酸50μL/孔，反應(yīng)液從黃色變成棕色。

測(cè)定：用酶標(biāo)儀測(cè)定終止反應(yīng)后的酶標(biāo)板的OD450值。以O(shè)D450值接近1.0時(shí)的酶標(biāo)抗體稀釋后的濃度為其效價(jià)，并根據(jù)其效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原合成紫外掃描結(jié)果 從圖1中可以看出三聚氰胺的特征峰在219nm附近，牛血清白蛋白在228nm和278nm附近均有吸收峰，人工抗原MEL-BSA在225nm和266nm附近均有吸收峰。MEL-BSA保留了牛血清白蛋白在228處最大吸收峰并且發(fā)生了偏移。偶聯(lián)物MEL-BSA在266nm附近有吸收峰與龔云飛等[12]寫的三聚氰胺人工抗原及多克隆抗體的制備報(bào)道的一致。

2.2 人工抗原偶聯(lián)比 本實(shí)驗(yàn)制備的三聚氰胺人工免疫原，在波長(zhǎng)位241nm處，半抗原、載體蛋白、偶聯(lián)物均有較強(qiáng)的紫外吸收，根據(jù)公式（1）可計(jì)算得出半抗原與載體蛋白偶聯(lián)比為29.35：1，偶聯(lián)比較高。

2.3 酶標(biāo)抗原合成紫外掃描結(jié)果 由圖2可知，反應(yīng)產(chǎn)物的吸收峰是MEL-BSA和HRP吸收峰的疊加，說(shuō)明反應(yīng)產(chǎn)物是MEL-BSA和HRP的結(jié)合物，表明偶聯(lián)成功，酶標(biāo)抗原合成成功。

由圖3可知，反應(yīng)產(chǎn)物的吸收峰是MEL-BSA和HRP吸收峰的疊加，說(shuō)明反應(yīng)產(chǎn)物是MEL-BSA和HRP的結(jié)合物，表明偶聯(lián)成功，酶標(biāo)抗原合成成功。

由圖2和圖3比較可以看出，戊二醛交聯(lián)法吸收峰的疊加主要在200～300nm區(qū)間，而辣根過(guò)氧化物的吸收峰在350～450的區(qū)間范圍內(nèi)，而戊二醛交聯(lián)法的吸收峰明顯高于HRP可能是造成了HRP之間的交聯(lián)。所以采用改良的過(guò)碘酸鈉法來(lái)酶標(biāo)抗原效果比戊二醛法交聯(lián)法好。

2.4 固相抗原-酶標(biāo)抗體棋盤滴定法數(shù)據(jù) 由表1可以看出抗原的濃度為1：3 200，抗體的濃度為1：8 000時(shí)，酶標(biāo)儀的數(shù)據(jù)為1.028，此位置抗原和抗體消耗的量均少，效果又好，表明三聚氰胺人工抗原合成成功。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)紫外鑒定和三聚氰胺抗原抗體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)來(lái)直接證明三聚氰胺人工抗原是否合成，能夠在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，由于抗體合成時(shí)間較長(zhǎng)（1～2月），利用本實(shí)驗(yàn)室之前合成好的三聚氰胺抗體進(jìn)行驗(yàn)證，三聚氰胺半抗原的偶聯(lián)比為29.35：1，說(shuō)明三聚氰胺結(jié)合在牛血清白蛋白上的數(shù)量大，所攜帶的抗原決定簇多，容易刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。接下來(lái)可進(jìn)行三聚氰胺抗體的合成，并為三聚氰胺ELISA試劑盒的研制提供了基礎(chǔ)。

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