重組人生長(zhǎng)激素對(duì)體外人中性粒細(xì)胞功能影響

吳新海 郗文斌 屠偉峰

重組人生長(zhǎng)激素對(duì)體外人中性粒細(xì)胞功能影響

吳新海 郗文斌 屠偉峰

目的 觀察重組人生長(zhǎng)激素(rhGH)對(duì)有無(wú)脂多糖(LPS)刺激的離體培養(yǎng)中性粒細(xì)胞(PMNs)呼吸爆發(fā)和粘附功能的影響。方法 分離純化人外周靜脈血PMN,加或不加LPS與三個(gè)不同劑量(10 ng/ml,100 ng/m l和1000 ng/ml)的rhGH共同孵育3 h,檢測(cè)不同試驗(yàn)組的PMN呼吸爆發(fā)和粘附功能。結(jié)果 低濃度的rhGH(10 ng/ml)不影響PMNs的呼吸爆發(fā)功能和粘附功能,高濃度的的rhGH (100 ng/m l,1000 ng/ml)增強(qiáng)PMN的呼吸爆發(fā)和粘附功能,rhGH不影響LPS刺激的PMN的呼吸爆發(fā)功能,能增強(qiáng)LPS刺激的PMN的粘附功能。結(jié)論 一定濃度的rhGH能活化PMNs的呼吸爆發(fā)和粘附功能,增加LPS活化的PMNs與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附,加重炎癥反應(yīng)時(shí)PMNs對(duì)組織的損傷作用。

重組人生長(zhǎng)激素;中性粒細(xì)胞;呼吸爆發(fā);粘附

重組人生長(zhǎng)激素(rhGH)由于具有促進(jìn)蛋白合成、加速創(chuàng)面愈合等特點(diǎn),已被臨床用于燒傷、膿毒癥、大手術(shù)術(shù)后等重癥患者的輔助治療。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn),rhGH不僅調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝,還對(duì)免疫系統(tǒng)和免疫細(xì)胞的功能有調(diào)節(jié)作用[1]。本研究將探討rhGH對(duì)離體培養(yǎng)的中性粒細(xì)胞(PMNs)呼吸爆發(fā)、與內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 percoll分離液(Amersham Biosciences公司),胎牛血清(杭州四季青),RPMI-1640(Gibcol),國(guó)產(chǎn)rhGH (長(zhǎng)春金賽藥業(yè)有限公司),內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV-304)由南方醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)中心饋贈(zèng);PMA和LPS購(gòu)自sigma公司,NBT(上海華舜生物公司)。NAPCO 5410型CO2孵箱,biocell ht2酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 外周血PMNs的分離 取健康人外周靜脈血15ml肝素抗凝(10 u/ml),采用percoll不連續(xù)密度梯度離心法分離PMNs[2]:取72%的percoll液15ml加于離心管底部,再輕輕將同體積63%的percoll液加在上面;然后將抗凝全血緩慢加在percoll之上;4℃,1800 rpm,離心25min。從分離液中取出PMNs,離心,去上清,用低滲溶漲法破除少量的紅細(xì)胞,RPMI-1640沖洗一次;用RPMI1640培養(yǎng)基(含 10%的胎牛血清, 100 u/ml的青霉素和100u/m l的鏈霉素)制成PMNs懸液,調(diào)整其濃度為 2×106/m l。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)排斥法證實(shí)其活力＞98%, W right-Giemsa染色鑒定其純度＞95%。

1.2.2 分組 根據(jù)有無(wú)LPS刺激及不同濃度的rhGH分6組對(duì)照組(C組);LPS(100 ng/ml)組(L組);10 ng/ml rhGH組(R 1組),100 ng/m l rhGH組(R 2組),1000 ng/ml rhGH組(R 3組)和100 ng/ml LPS+100 ng/m l rhGH組(LR組)將分組后的PMNs置37℃,5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)3 h檢測(cè)呼吸爆發(fā)和粘附。

1.2.3 ECV-304細(xì)胞株的培養(yǎng) 用RPMI1640培養(yǎng)基將ECV-304細(xì)胞株制成 1×108/l的細(xì)胞懸液,加入 24孔培養(yǎng)板中,置37℃,5%CO2的孵育箱中培養(yǎng),倒置顯微鏡觀察至細(xì)胞呈鋪路石狀鑲嵌排列的單層備用。

1.2.4 PMNs呼吸爆發(fā)的檢測(cè) 參照Piva E,De Toni S等[3]的方法通過(guò)檢測(cè)NADPH氧化酶的活性代表PMNs的呼吸爆發(fā)功能:在96孔板上,每孔加入50μl(2×106ml)的PMNs懸液、50μl的PBS和50μl的PMA(1.625μmol/l),室溫震蕩孵育10min,加入NBT(24μmol/l)后,立即用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm的條件下測(cè)一次吸光度(A),每隔5min測(cè)一次吸光度,一直測(cè)到 30 min,每份樣本重復(fù)5次,取其平均值(A)。根據(jù)NBT的減少率來(lái)評(píng)價(jià)PMNs呼吸爆能力(NADPH氧化酶活性),計(jì)算公式為:

1.2.5 PMNs與內(nèi)皮細(xì)胞粘附率的測(cè)定 將長(zhǎng)成單層的ECV-304的培養(yǎng)基去掉,從各組培養(yǎng)的PMNs懸液中取0.5 m l加到ECV-304之上,放入培養(yǎng)箱中孵育30min,取上清液置不同試管中,并用等量的PBS液沖洗2次,沖洗液分別放置相應(yīng)的試管中;上清液和沖洗液混均,計(jì)數(shù)脫落的PMNs。用以下公式計(jì)算PMNs與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附率:

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)用表示,用SPSS12.0軟件進(jìn)行組間 t檢驗(yàn),P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rhGH對(duì)有無(wú)LPS刺激的PMNs呼吸爆發(fā)功能的影響

與對(duì)照組相比,10 ng/ml的rhGH與PMNs共同孵育3 h不增強(qiáng)PMNs呼吸爆發(fā)能力;而100 ng/m l和1000 ng/m l的rhGH與PMNs共同孵育能增強(qiáng)PMNs的呼吸爆發(fā)能力,但兩者之間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加入LPS刺激時(shí),PMNs的呼吸爆發(fā)功能增強(qiáng);100 ng/ml的rhGH不影響LPS刺激的PMNs呼吸爆發(fā)功能。(見(jiàn)表1)。

表1 各實(shí)驗(yàn)組對(duì)PMNs呼吸爆發(fā)和粘附的影響

2.2 rhGH對(duì)有無(wú)LPS刺激的PMNs與內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響

與對(duì)照組相比,10 ng/ml的rhGh不影響PMNs與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附率,100 ng/ml的rhGH和1000 ng/m l的rhGH能增強(qiáng)PMNs與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附(見(jiàn)表1);加入LPS刺激時(shí),PMNs的與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附能力增強(qiáng),rhGH能增加LPS刺激的PMNs與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附率。

3 討論

本試驗(yàn)探討不同濃度的rhGH對(duì)離體培養(yǎng)的PMNs呼吸爆發(fā)功能及與內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn) rhGH能增強(qiáng)PMNs的呼吸爆發(fā)功能,增加與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附率,這一作用呈劑量依賴性,只有達(dá)到一定的濃度這一影響才有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是當(dāng)繼續(xù)增加rhGH的濃度時(shí),這一作用并沒(méi)有隨之增加。

早期臨床研究發(fā)現(xiàn):生長(zhǎng)激素(GH)依賴的身材矮小患者常伴隨有慢性肉芽腫疾病,肢端肥大癥的患者的PMNs呼吸爆發(fā)功能增強(qiáng)和趨化能力減弱[4],推測(cè)GH與PMNs的功能存在某種聯(lián)系,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這種假設(shè)。正常成人血漿的GH的濃度在3～5ng/ml,而肢端肥大癥患者可高達(dá)100～1000 ng/ml,所以實(shí)驗(yàn)為了探討這一影響與濃度的關(guān)系,我們?cè)O(shè)置了10ng/m l、100 ng/ml、1000 ng/ml三個(gè)濃度組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度的10ng/m l的rhGH不影響PMNs的呼吸爆發(fā)和粘附功能,因此我們推測(cè)在生理狀態(tài)下分泌的 GH可能不影響PMNs的功能,只有在某些病理狀態(tài)下(如巨人癥和肢端肥大癥)或者用rhGH治療時(shí),血清中的GH的常達(dá)到一定的濃度(＞100 ng/ml),才會(huì)對(duì)PMNs的功能產(chǎn)生影響,但1000ng/ m l的rhGH的影響并不比100 ng/ml的rhGH的更顯著;由于條件的限制,在本實(shí)驗(yàn)我們只設(shè)置了三個(gè)濃度組,要闡明 rh-GH對(duì)PMNs影響的的量效關(guān)系需進(jìn)一步研究。

rhGH常用于治療燒傷、膿毒癥患者,而這些患者體內(nèi)大多處于炎癥反應(yīng)狀態(tài),PMN的功能被激活;最近有研究認(rèn)為ICU患者使用大劑量的rhGH治療,住院時(shí)間延長(zhǎng),死亡率增加[5],可能與炎癥反應(yīng)加重有關(guān);本實(shí)驗(yàn)為了觀察rhGH對(duì)活化的PMNs功能的影響,我們加入LPS作為刺激劑,觀察rh-GH對(duì)LPS刺激的PMNs的呼吸爆發(fā)和粘附功能的影響;LPS是內(nèi)毒素的主要成分,LPS可通過(guò)活化PMNs的呼吸爆發(fā)和粘附等功能[6],增加機(jī)體的炎癥反應(yīng)而加重組織的損傷。在本實(shí)驗(yàn)中,我們進(jìn)一步證實(shí)LPS能增強(qiáng)PMNs的呼吸爆發(fā)和粘附功能;而rhGH不影響LPS刺激的PMNs的呼吸爆發(fā),但能增加LPS活化的PMNs與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附率,所以用于治療重癥患者可能會(huì)加重活化的PMNs的組織的損傷;Liu等[7,8]研究也發(fā)現(xiàn),GH治療增加膿毒癥腹膜炎大鼠循環(huán)中PMN的CD11 b的表達(dá)及呼吸爆發(fā)能力并促進(jìn)肺微血管的損傷;Hansen等研究認(rèn)為[9],GH和IGF-1都不直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VCAM-1的作用,但 GH能通過(guò)間接調(diào)制循環(huán)中的介質(zhì)增加VCAM-1的表達(dá),有利于PMN粘附游走到血管外,發(fā)揮組織損傷的作用。

綜上所述,rhGH能增強(qiáng)PMNs的呼吸爆發(fā)和與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附;而且能增強(qiáng)LPS活化的PMNs與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附;所以臨床應(yīng)用rhGH治療可增強(qiáng)機(jī)體的防御能力,但是當(dāng)機(jī)體處于炎癥反應(yīng)狀態(tài)時(shí),可能會(huì)加重PMNs對(duì)組織的損傷。

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Effects of recombinant human grow th hormoneon function of polymorphonuclear neutrophils in vitro

WU Xin-hai,XIWen-bing,TU Wei-feng.Department of anesthesiology,Shenzhen Hospital,Peaking University, Shenzhen518036,China

Objective To investigate the effectsof recombinant human growth hormone(rhGH)on respiratory burstand adhesion of polymorphonuclear neutrophils(PMNs)stimulated orunstimulated by lipopolysaccharide(LPS).M ethods PMNswere isolated and purified from the peripheral venous.PMNs stimulated or unstimulated by LPSwere cultured with different concentration of rhGH(10 ng/m l,100 ng/m land 1000 ng/m l)for 3 h to detect respiratory burst and adhere of PMNs.Results The lower concentration of rhGH(100 ng/ml) doesn'taffect the respiratory burstand adhesion of PMNs.The high concentration of rhGH((100 ng/ml,1000 ng/ml)enhance the respiratory burstand adhesion of PMNs.rhGH doesn'taffect the respiratory burst of PMNs stimulated by LPS.rhGH enhance the adhesion of PMNs stimulated by LPS.Conclusion rhGH in some concentration can activate the repiratory burstand adhere of PMNs,and increase adhesion of PMNs stimulated by LPS to provoke organ injury.

Human grow th hormone;Polymorphonuclear neutrophils;Respiratory burst;Adhesion

518036北京大學(xué)深圳醫(yī)院麻醉科(吳新海);廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院麻醉科(郗文斌 屠偉峰)