蛋清中溶菌酶提取技術(shù)的研究

趙喜喬 趙榮昊 張夢(mèng)熙 吳漢東

溶菌酶又稱胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，是一種葡萄糖苷酶。它是英國(guó)細(xì)菌學(xué)家弗萊明于1922年在鼻粘液中發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)力殺菌物質(zhì)。溶菌酶的發(fā)現(xiàn)是近代酶化學(xué)研究的最大成果之一。

雞蛋清中的溶菌酶是研究得最清楚的一種溶菌酶。它是一種純品為白色或微黃色的結(jié)晶體，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，易溶于水，不溶于丙酮、乙醇的堿性球蛋白。它能夠催化某些細(xì)菌細(xì)胞壁多糖的水解，從而溶解這些細(xì)菌的細(xì)胞壁。由于溶菌酶本身是一種天然蛋白質(zhì)，無毒性，廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)、發(fā)酵工程、基因工程、細(xì)胞工程等，溶菌酶所具有的廣泛用途被國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者所研究。為此本試驗(yàn)在結(jié)合實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件對(duì)雞蛋清溶菌酶的提取技術(shù)進(jìn)行了探究。

一、材料與方法

（一）材料

市售新鮮雞蛋；枯草芽孢桿菌；標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker；724樹脂；聚乙二醇4000：樣品溶解液；濃縮膠；電極緩沖液；固定液；染色液；脫色液等常用化學(xué)試劑。

（二）方法

（1）溶菌酶的提取及純化

雞蛋清樣品制備及粗分離。將洗凈的4～5個(gè)新鮮雞蛋打破，分離得雞蛋清，量其體積，加入兩倍蛋清體積的去離子水，攪拌拌勻，過濾雜質(zhì)，然后用1mol/L的HCI溶液調(diào)pH值至7.0左右，再用脫脂棉過濾收集濾液。

724弱酸性陽(yáng)離子交換樹脂的再生及層析。

724樹脂再生處理：首先將干樹脂清水浸泡，充水膨脹除去細(xì)小顆粒和較大雜質(zhì)；1mol/L的HCI溶液浸泡4～6 h，用去離子水洗至pH值接近5.5；1 mol/L的NaOH浸泡6 h，去離子水洗至近中性；再用1mol/L的NaCl溶液處理6 h，使之轉(zhuǎn)型為Na+型，pH值不小于6.5。吸干溶液，加0.151mol/L、pH值為6.5的磷酸緩沖液平衡，待用；吸干緩沖液后，將處理好的蛋清約200ml，加入約32 g再生的724樹脂中，緩慢攪拌吸附6 h，4℃靜置過夜。

洗滌、洗脫：待分層后，將蛋清液倒去，用去離子水反復(fù)沖洗，以去除雜蛋白。濾干樹脂，用等體積的0.15mol/L pH值為6.5的磷酸緩沖液洗滌，加入等量的10%（NH4）2SO4溶液攪拌洗脫30 min，使溶菌酶從樹脂上洗脫下來。收集洗脫液.4℃冰箱靜置過夜。次日，有白色沉淀析出，離心收集沉淀，沉淀物為溶菌酶粗產(chǎn)品。

聚乙二醇濃縮：鹽析物用1倍去離子水溶解成稀糊狀。裝入透析袋.在裝有聚乙二醇的試管中吸水濃縮，收集濃縮液；透析除鹽、去堿性蛋白：4℃條件下，用去離子水透析24 h左右.離心去除透析袋中沉淀，向透析清液中慢慢加入l mol/L氫氧化鈉溶液.同時(shí)不斷攪拌，使pH值上升至8.0～9.0，如有白色沉淀，即離心去除。

冷凍干燥：用3 mol/L鹽酸調(diào)pH值至5.0.冷凍干燥。即得白色片狀溶菌酶。

（2）溶茵酶的檢測(cè)

溶菌酶得率：收集冷凍干燥后留在培養(yǎng)皿上的白色粉末，稱重。

純度檢測(cè)：采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法。①凝膠板的制備：用30%分離膠貯液、pH值為8.9分離膠緩沖液、10%濃縮膠貯液、pH值為6.7濃縮膠緩沖液、10%SDS、1%TEMED、重蒸餾水、10%APS溶液配制而成；②溶菌酶的處理：用磷酸緩沖液點(diǎn)樣于凝膠板上；③電泳：電流為10mA，時(shí)間4 h；④固定、染色和脫色：電泳完畢，將膠板從玻璃板上取下，分別在固定液與染色液中浸泡10～30 min，用水漂洗干凈。再用脫色液脫色。

溶菌酶活力測(cè)定：①菌懸液的制備：將培養(yǎng)24 h的枯草芽孢桿菌用蒸餾水將菌體從培養(yǎng)基上洗下，4000r/min離心20 min，傾去上清液。用冷丙酮洗滌，4000r/min離心20 min.不溶物即為菌體。取5mg菌體，加入30mL，0.1mol/L pH值為6.2的磷酸緩沖液，制備菌懸液，于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光值（A值）；②酶液的制備：稱取溶菌酶粉末5mg，用0.1 mol/L， pH值為6.2的磷酸緩沖液配成l mg/mL的酶液。使用時(shí)稀釋20倍；③活力測(cè)定：將酶液和底物懸液分別置于25℃水浴保溫10～15min.吸取菌懸液2.8 mL，然后加入酶液0.2mL，迅速搖勻。每隔1min測(cè)定1次A450值，共測(cè)4次，計(jì)算酶的活力單位。

二、結(jié)果與分析

（一）724樹脂再生

在實(shí)驗(yàn)過程中再生前的724樹脂，呈深褐色；經(jīng)過1mol/l的HCI溶液浸泡4 h水洗后的樹脂，呈淺黃色；經(jīng)過1mol/l NaOH溶液浸泡6 h水洗后的樹脂，樹脂變?yōu)槿馍?；吸附蛋清后的樹脂，顏色發(fā)白，變得很黏稠。

（二）溶菌酶提取及檢測(cè)

（1）溶茵酶的得率及純度檢測(cè)

將冷凍干燥后收到的溶菌酶稱重，約為0.0317g。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳純度檢測(cè)。從標(biāo)準(zhǔn)蛋向Marker的條帶來看，最下面的1條帶為溶菌酶的條帶，分子量為14.4kD，與之相對(duì)應(yīng)右邊的蛋白樣品中也分離得到了溶菌酶的條帶，而且加樣量越大顏色越深。結(jié)果表明，該方法從雞蛋清中分離出的溶菌酶純度較高，大部分的雜蛋白已除去，而且加樣量越大顏色越深。顏色的深淺與染料的選擇及濃度和染色時(shí)間有關(guān)，一般染料濃度越高，染色時(shí)間越長(zhǎng)，染色越深。但脫色也更難。在本試驗(yàn)中，固定染色0.5h比較合適，脫色時(shí)在搖床上洗脫過夜效果最好。

（2）溶菌酶活力檢測(cè) 表1為加入溶菌酶后.枯草芽孢桿菌在4 min內(nèi).每隔l min所測(cè)的吸光值。根據(jù)酶活力計(jì)算公式。算出該酶的活力。結(jié)果表明。所提取溶菌酶的活力為7793 U/mg。

表1加入溶菌酶后枯草芽孢桿菌的吸光值項(xiàng)目

三、討論

目前溶菌酶的提取主要就是對(duì)蛋清先粗提再純化的一個(gè)過程。本試驗(yàn)在實(shí)施過程中，根據(jù)試驗(yàn)相關(guān)材料的理化性質(zhì)，對(duì)試驗(yàn)步驟做了一些改進(jìn).以期達(dá)到更好的效果。如724樹脂經(jīng)堿液浸泡過后很難洗至中性，且堿性很強(qiáng)。改用NACL溶液浸泡同樣可以將樹脂轉(zhuǎn)為Na+型，且很容易洗至中性。又如用10%的硫酸銨洗脫樹脂吸附的物質(zhì)時(shí)。需要過柱，但因?yàn)檫^柱有拖尾現(xiàn)象，所以直接用攪拌洗脫，多洗幾次，交換也能很充分，避免了過柱的麻煩。另外，聚乙二醇濃縮和離心濃縮可交替反復(fù)使用，視具體情況而定。從試驗(yàn)結(jié)果可以看到，提取出來的溶菌酶的純度和活力都比較高，說明了提取純化方法的選擇和交叉運(yùn)用只要符合提取物的理化性質(zhì)，都能有較好的效果，而其對(duì)溶菌酶提取效果的影響則需要進(jìn)一步探究。