垃圾中轉站生物氣溶膠中優(yōu)勢細菌的分離與鑒定?

摘 要：為了了解垃圾中轉站空氣中主要細菌的種類，給氣溶膠的防治策略提供參考依據(jù)，采用Andersen-6級撞擊式空氣微生物采樣器在多個生活垃圾中轉站采集樣品，采用傳統(tǒng)分離純化方法獲得了4株優(yōu)勢細菌，菌種編號分別為3、5、6和9號，這4個菌落總和占到了總菌落數(shù)的84.3%；通過菌落和菌體形態(tài)、革蘭氏染色、生理生化指標、16S rRNA基因序列分析和同源性比較等方法，3、5、6和9號菌株分別被鑒定為極考克氏菌、拉浩爾谷農(nóng)球菌、條紋微桿菌和解淀粉芽孢桿菌。

關鍵詞：垃圾中轉站；生物氣溶膠；優(yōu)勢細菌；形態(tài)學鑒定；分子生物學鑒定

中圖分類號：S511 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2023）05-0001-04

Abstract：In order to know dominant bacteria species in bioaerosol from the refuse transfer station and provide reference for the control strategy of aerosol， Anderson six-stage sampler was used to collect samples from several refuse transfer stations. And four dominant strains were obtained by traditional separation and purification methods， which were coded No. 3， No. 5， No. 6 and No. 9， accounting for 84.3% of the total colonies. Based on colony and bacterium morphology， Gram stain， physiological and biochemical indexes， sequence analysis of 16S rRNA gene， and homology comparison， strains No.3， No. 5， No. 6 and No. 9 were identified as Kocuria polaris， Agrococcus lahaulensis， Microbacterium lacus， and Bacillus amyloliquefaciens.

Key words：refuse transfer station; bioaerosol; dominant bacteria; morphological identification; molecular biological identification

生物氣溶膠是源自植物、動物和微生物死的或活的空氣粒子[1]，粒徑在0.001～100 μm之間。由于它們體積極小，重量極輕，可以在大氣層中停留足夠長的時間，并進行長距離飄移，在大氣、生物圈和生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮作用，從而對人類健康和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生一定影響[2]。生物氣溶膠微生物是生物氣溶膠中的重要一類，包括細菌、真菌、放線菌和病毒等，其在大氣中的濃度具有明顯的時空差異，受到許多因素的影響，包括微生物來源、人類活動和環(huán)境條件等，需要在不同地區(qū)進行長期監(jiān)測[3]。

隨著城鎮(zhèn)化進程的加快，城市生活垃圾的產(chǎn)量與日俱增。據(jù)靈動核心的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2019年我國城市生活垃圾產(chǎn)生量達3.43億t，且自我國實施垃圾分類政策以來，生活垃圾中有機質含量大副提升，在中轉站堆放的過程中容易滋生細菌、真菌和病毒等微生物。附著在垃圾表面的這些微生物伴隨著垃圾的收集、翻倒和轉運等處置活動形成微生物氣溶膠，在空氣中傳播擴散，時間一長這些微生物氣溶膠便有可能通過口鼻吸入和皮膚接觸等途徑影響站內(nèi)工作人員及中轉站附近居民的健康，導致人體出現(xiàn)如哮喘、過敏性鼻炎、支氣管炎、閉鎖性結膜炎和器質性塵埃中毒綜合征等致敏性、毒性和致病性癥狀[4-5]。

為了解垃圾中轉站空氣中細菌微生物的種類，筆者從垃圾中轉站環(huán)境中采集樣本進行優(yōu)勢細菌的分離與鑒定，以確定垃圾中轉站內(nèi)優(yōu)勢細菌種類，為進一步研究中轉站內(nèi)生物氣溶膠中細菌的生物學特性及微生物氣溶膠的防治策略提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

微生物氣溶膠樣品采自不同的生活垃圾中轉站，每個垃圾站設置5 個取樣點。試驗所用培養(yǎng)基有LB培養(yǎng)基（蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，水1 000 mL，用1 mol/L的NaOH調節(jié)pH值至7.2±0.2，121℃高溫滅菌15 min，在LB液體培養(yǎng)基中加入15.0 g瓊脂即為固體培養(yǎng)基）和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，牛肉膏3.0 g，水1 000 mL，用1 mol/L的NaOH調節(jié)pH值至7.2±0.2）。

主要儀器設備有Andersen-6級撞擊式空氣微生物采樣器（ETW-6型，常州億通分析儀器制造有限公司）、立式壓力蒸氣滅菌鍋（BXM-30R，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、恒溫振蕩培養(yǎng)箱（ZQZY-AS9，上海知楚儀器有限公司）、生化培養(yǎng)箱（LRH-400A，廣東泰宏君科學儀器股份有限公司）、光學顯微鏡（Axiolab 5，德國ZEISS）、移液器（1 000 μL、100 μL、10 μL， Eppendorf Research plus）、快速混勻器（XH-C，金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的采集 取樣時間為每天上午9：00—9：30，每個采樣點每次采集2組平行樣品，2個采樣器同時工作，收集垃圾中轉站空氣中的生物氣溶膠顆粒。該采樣器共有6級，第一級直徑＞7.0 μm，第二級直徑為4.7～7.0 μm，第三級直徑為3.3～4.7 μm，第四級直徑為2.1～3.3 μm，第五級直徑為1.1～2.1 μm，第六級直徑為0.65～1.10 μm。每級篩板下面放置1個直徑為90 mm、帶有LB固體培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)皿。抽吸泵將流量為28.3 L/min的氣流泵送至各級，空氣流速逐級增大，從而把空氣中的帶菌粒子按粒徑的大小分別捕獲到各級培養(yǎng)皿上?？諝獠蓸悠骶嚯x地面1.5 m（人體呼吸高度）。每次取樣3 min，當吸入的空氣量達到所需值時，逐級取出培養(yǎng)皿，迅速密封后放入樣品箱帶回實驗室，將采集回的培養(yǎng)皿置于（37±2）℃下恒溫培養(yǎng)48 h。在樣品采集的同時，使用溫濕度計監(jiān)測并記錄采樣時的溫度和空氣相對濕度。

1.2.2 菌株的分離與純化 將取回的樣品恒溫培養(yǎng)48 h后，挑取平板中單個優(yōu)勢細菌于LB液體培養(yǎng)基中再培養(yǎng)48 h，取菌液梯度稀釋后繼續(xù)于LB固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，（37±2）℃下恒溫培養(yǎng)48 h，觀察菌落在平板中的形態(tài)，并進行革蘭氏染色鏡檢，若菌落形態(tài)或菌體形態(tài)多樣，則存在雜菌。重復上述操作，直至菌落和顯微鏡觀察時菌落及菌體形態(tài)均單一，則菌株已純化，放于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌株生理生化鑒定 菌種的生理生化鑒定方法參照《伯杰細菌鑒定手冊》，對各菌進行了過氧化氫酶、葡萄糖產(chǎn)氣、MR試驗、吲哚試驗、水解淀粉和明膠液化等試驗。

1.2.4 菌株分子生物學鑒定 以LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液為模板，采用通用引物27F/1492R[6]擴增16S rRNA基因。正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反應體系（50 μL）：10×buffer 5 μL，dNTP 1 μL，正反向引物各1 μL，模版DNA 0.5 μL，Taq聚合酶0.5 μL，超純水41 μL。PCR擴增程序為：95℃預變性5 min；95℃變性1 min，52℃復性1 min，72℃延伸1.5 min，循環(huán)34次；72℃延伸10 min。將產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結果用BLAST軟件與GenBank中的16S rRNA基因序列進行比對。采用Mega5軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

優(yōu)勢菌所占百分比=單一菌種數(shù)/總菌數(shù)×100%

式中：單一菌種數(shù)是指5個垃圾站內(nèi)菌落形態(tài)一致的細菌之和；總菌數(shù)是指5個垃圾站樣品菌落數(shù)之和。

2 結果與分析

2.1 優(yōu)勢菌株的分離

根據(jù)菌落形態(tài)及菌體形態(tài)觀察，對5個站點采集到的細菌菌落進行統(tǒng)計，結果發(fā)現(xiàn)，雖然取樣垃圾站不同，但不同站點的細菌菌落基本是一致，這可能是因為居民的生活習慣差不多，垃圾的組分相近，氣候環(huán)境一致導致站內(nèi)空氣中微生物相近。如表1所示，菌種編號為3、5、6和9號的這4種菌落總和占到了總菌落數(shù)的84.3%，因此對這4種菌落做進一步分離純化。

2.2 優(yōu)勢細菌的形態(tài)

對4株優(yōu)勢微生物進行革蘭氏染色，結果如表2和圖1所示，其中3株為革蘭氏陽性菌，1株為革蘭氏陰性菌。

2.3 菌種的理化特性

菌株的生理生化試驗結果如表3所示，3號菌株過氧化氫酶、葡萄糖產(chǎn)氣、MR試驗及H2S試驗的結果均為陽性，其他試驗結果為陰性；5號菌株除葡萄糖產(chǎn)氣、吲哚試驗和檸檬酸鹽的利用試驗為陰性外，其他試驗結果均為陽性；6號菌株除VP試驗和明膠液化試驗結果為陰性外，其他各項試驗結果均為陽性；9號菌株的過氧化氫酶、MR試驗、明

膠液化及檸檬酸鹽的利用試驗結果為陽性，其他試征基本一致[7]。

2.4 菌種鑒定

16S rRNA基因是細菌染色體上編碼16S rRNA相對應的DNA序列，可變區(qū)序列因細菌不同而異，恒定區(qū)序列基本保守，因此可通過比對可變區(qū)序列的差異對不同屬、種的細菌進行分類鑒定[8]。

將4個菌株的測序結果分別在NCBI用Blast進行同源性檢索，然后采用鄰接法構建菌株的系統(tǒng)進化樹，結果如圖2所示，3號菌株的序列與極考克氏菌（Kocuria polaris）的序列有超過99%的相似性，5號菌株的序列與拉浩爾谷農(nóng)球菌（Agrococcus lahaulensis）的序列有超過98%的相似性，6號菌株 的序列與條紋微桿菌（Microbacterium lacus）的序列100%相似，9號菌株的序列與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的序列有超過99%的相似性。

3 結 論

微生物氣溶膠是含有包括細菌、真菌、病毒以及致敏花粉、霉菌孢子、蕨類孢子和寄生蟲卵等有生物性粒子的氣溶膠[9]，它除有一般氣溶膠的特征外，還具有致病性和傳染性。垃圾處理場所微生物氣溶膠的擴散和傳播是造成生物性危害的主要原因，當垃圾轉運站工作人員與微生物氣溶膠密切接觸，吸入了這些致病菌或人體的防御能力下降的時候，就會引發(fā)各種疾病，產(chǎn)生如鼻炎、哮喘、慢性支氣管炎、皮膚過敏等癥狀[10]。

該研究從垃圾中轉站生物氣溶膠中分離純化得到了4株優(yōu)勢細菌，通過菌落和菌體形態(tài)觀察、生理生化特性和16S rRNA基因序列比較分析，確定了3號菌株為極考克氏菌、5號菌株為拉浩爾谷農(nóng)球菌、6號菌株為條紋微桿菌、9號菌株為解淀粉芽孢桿菌。其中，9號的解淀粉芽孢桿菌由于自身生長過程中會產(chǎn)生一系列代謝產(chǎn)物，使其具有廣泛的抑制真菌和細菌的能力，從而抑制環(huán)境中有害微生物的生理生化活動；而6號的Microbacterium lacus菌與馬嘉偉等[9]發(fā)現(xiàn)的Microbacterium 菌是一致的，該菌是垃圾滲濾液處理區(qū)空氣中的優(yōu)勢菌，存在可能誘發(fā)疾病的風險；3號的Kocuria polaris菌和5號的Agrococcus lahaulensis菌對人和動物沒有直接的危害。然而，生物氣溶膠的危害除了菌體本身可能致病外，還與菌體的濃度及氣溶膠粒徑大小情況等因素有關，為了更清楚地了解各菌是否對人體健康有影響，還需做進一步的試驗研究。

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（責任編輯：成 平）