脫細(xì)胞角膜基質(zhì)制備方法研究進(jìn)展

摘 要：脫細(xì)胞角膜基質(zhì)作為組織工程角膜的研究新熱點(diǎn)，不僅保持了天然角膜的結(jié)構(gòu)特征和力學(xué)性能，且含有人工合成支架所不具備的細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，為種子細(xì)胞生長(zhǎng)提供了理想的環(huán)境，同時(shí)也去除了組織中可能引發(fā)免疫排斥反應(yīng)的細(xì)胞成分。本文對(duì)最近幾年異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法進(jìn)行綜述，并指出了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：脫細(xì)胞角膜基質(zhì) 組織工程 制備方法

中圖分類號(hào)：R32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2013）04（a）-0226-01

異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)作為組織工程角膜的支架具有免疫原性低、含多種細(xì)胞因子、機(jī)械強(qiáng)度好、可塑性好等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用兔、牛、犬、豬等多種動(dòng)物作為角膜供體，并獲得了不同程度的移植效果。理想的脫細(xì)胞方法的目的是完全去除組織中的細(xì)胞成分及核物質(zhì)，從而減少移植受者免疫反應(yīng)，同時(shí)保持細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的結(jié)構(gòu)和功能蛋白，維持角膜的透明度，并且能夠支持角膜細(xì)胞生長(zhǎng)。現(xiàn)就脫細(xì)胞角膜基質(zhì)的制備方法及各方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行綜述。

1 物理制備方法

1.1 反復(fù)凍融法

反復(fù)凍融法是利用低溫下細(xì)胞內(nèi)部會(huì)產(chǎn)生冰晶，剩余的細(xì)胞液由于鹽濃度增高而引起溶脹，再室溫融解，反復(fù)多次即可使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，從而使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。單純使用該方法，脫細(xì)胞效果并不理想，因此常聯(lián)合其它脫細(xì)胞方法。

1.2 高靜壓技術(shù)

高靜壓技術(shù)（HHP）的主要機(jī)理是使組織中細(xì)胞的細(xì)胞膜損傷，并影響細(xì)胞內(nèi)酶活力及細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和廢棄物的運(yùn)輸，從而使細(xì)胞裂解。利用高靜壓技術(shù)對(duì)豬角膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理，能夠有效去除細(xì)胞，并且保持了膠原纖維的排列結(jié)構(gòu)，同時(shí)減少糖胺聚糖（GAG）的損失。此外，HHP技術(shù)在處理過(guò)程中不添加去污劑，沒(méi)有細(xì)胞毒性，脫細(xì)胞的同時(shí)去除了角膜中的細(xì)菌和病毒。然而這項(xiàng)技術(shù)需要昂貴的專業(yè)設(shè)備，制備成本高，因而限制了其引用和發(fā)展。

2 化學(xué)制備方法

2.1 去污劑處理法

離子型去污劑能夠破壞蛋白與蛋白之間的連接結(jié)構(gòu)，從而使得蛋白質(zhì)發(fā)生變性作用。最常用的離子型去污劑是十二烷基磺酸鈉（SDS），其作為生物膜的溶解劑，能夠有效去除組織中的細(xì)胞成分。Du等[1]研究表明0.5%～1%SDS能夠有效去除細(xì)胞，且不破壞ECM的天然組織結(jié)構(gòu)。然而，SDS處理會(huì)降低GAG的總含量，損傷基底膜，并且造成膠原結(jié)構(gòu)松散。

非離子型去污劑不破壞蛋白與蛋白之間的連接，而只是破壞脂質(zhì)與脂質(zhì)之間和脂質(zhì)與蛋白之間的結(jié)構(gòu)，且作用溫和，已被廣泛應(yīng)用于脫細(xì)胞研究中。其中最常用的非離子型去污劑是TritonX-100。陳蘋等[2]研究發(fā)現(xiàn)1%TritonX-100能夠有效去除角膜基質(zhì)中的細(xì)胞成分，并且能夠維持膠原纖維結(jié)構(gòu)。但也有研究報(bào)道濃度為5%的TritonX-100對(duì)角膜的脫細(xì)胞效果不佳[1]。

兩性離子型去污劑能夠增溶膜蛋白并破壞蛋白-蛋白之間的相互作用，具有離子型及非離子型去污劑的雙重特性。其中最常用的兩性離子去污劑為CHAPS。但Du等[1]利用該去污劑處理豬角膜，發(fā)現(xiàn)去除角膜細(xì)胞的效果較差，角膜基質(zhì)中常會(huì)殘留細(xì)胞碎片。

2.2 酸、堿處理法

酸、堿通常與去污劑和醇類結(jié)合使用，能夠引起或是促進(jìn)生物分子的水解。Ponce Márquez等[3]使用過(guò)氧乙酸聯(lián)合乙醇對(duì)牛角膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理，但是脫細(xì)胞效果并不理想，組織邊緣仍有細(xì)胞殘留，說(shuō)明該方法仍有待改進(jìn)。

2.3 高滲溶液、低滲溶液處理法

利用高滲和低滲溶液能夠使細(xì)胞內(nèi)的滲透壓發(fā)生變化，如使用去離子水、低離子強(qiáng)度的溶液導(dǎo)致組織的細(xì)胞松解和細(xì)胞膜的破裂，從而達(dá)到脫細(xì)胞的目的。該方法操作簡(jiǎn)便，對(duì)組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞不明顯，但是脫細(xì)胞效果不佳，且所需時(shí)間較長(zhǎng)，故很少單獨(dú)應(yīng)用。

3 酶消化法

酶消化法主要用于對(duì)去污劑未去除干凈的細(xì)胞成分進(jìn)行進(jìn)一步清除，主要包括蛋白酶和核酸酶。最常用的蛋白酶主要有胰蛋白酶和中性蛋白酶。胰蛋白酶能夠溶解變性的蛋白質(zhì)，從而破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。在多項(xiàng)研究中，胰蛋白酶被用于分散角膜的ECM結(jié)構(gòu)，以利于之后的脫細(xì)胞試劑滲透進(jìn)入角膜內(nèi)部。此外，磷脂酶A2能夠水解細(xì)胞的磷脂成分，因而也被應(yīng)用于脫細(xì)胞處理，并取得了良好的脫細(xì)胞效果，但是角膜處理后GAG含量會(huì)顯著降低。

4 血清處理法

血清中含有核酸酶，能夠降解DNA和RNA。Shao等[4]首先提出單純用人血清對(duì)豬角膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理。之后，其改進(jìn)了方法，將人血清處理與電泳法相結(jié)合。先將豬角膜在無(wú)菌的100%人血清中孵育1天，之后對(duì)角膜進(jìn)行電泳。該方法能夠完全去除細(xì)胞，并且保持了角膜的透明度。

5 結(jié)語(yǔ)

脫細(xì)胞角膜基質(zhì)是構(gòu)建組織工程角膜理想的生物材料，具有優(yōu)良的生物相容性和組織相容性。要獲得比較理想的脫細(xì)胞效果，同時(shí)最大程度地保留原有組織結(jié)構(gòu)，通常需要多種脫細(xì)胞方法聯(lián)合應(yīng)用。建議應(yīng)用最溫和的方法進(jìn)行處理，從而將脫細(xì)胞過(guò)程對(duì)ECM的結(jié)構(gòu)、功能產(chǎn)生的影響降低到最小程度。一般先在高滲或低滲溶液浸泡，隨后用去污劑處理，從而獲得理想的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)。

參考文獻(xiàn)

[1]Du L，Wu X.Development and characterization of a full-thickness acellular porcine cornea matrix for tissue engineering[J].Artif Organs，2011，35（7）：691-705.

[2]陳蘋，傅瑤，范先群.豬角膜脫細(xì)胞基質(zhì)的制備及生物相容性的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 眼科研究，2006，24（4）：367-370.

[3]Ponce Márquez S，Martínez VS，McIntosh Ambrose W，et al. Decellularization of bovine corneas for tissue engineering applications[J].Acta Biomater.2009，5：1839-1847.

[4]Shao Y，Quyang L，Zhou Y，et al.Preparation and physical properties of a novel biocompatible porcine corneal acellularized matrix[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim，2010，46（7）：600-605.