乳鐵蛋白的分離純化方法研究

摘 要：牛初乳中含有極豐富的生物活性物質(zhì)，是提取和利用乳鐵蛋白的最適來源之一。乳鐵蛋白的分離純化方法較多，本文概述了鹽析和有機溶劑法、超濾法、離子交換色譜法、親和色譜法、吸附色譜法、固定化單克隆抗體法和混合模式擴張床吸附法等，就其工業(yè)化生產(chǎn)的前景進行了分析。

關(guān)鍵詞：乳鐵蛋白 分離純化 方法

中圖分類號：S5 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2013）04（b）-0002-02

20世紀40年代，從乳清蛋白中分離得到了一種含F(xiàn)e3+紅色蛋白，作為血清鐵結(jié)合傳遞蛋白（TF）的類似物，稱之為乳鐵蛋白（1actoferrin，Lf），又稱乳轉(zhuǎn)鐵蛋白，主要存在于大多數(shù)哺乳動物乳汁中的鐵結(jié)合糖蛋白。Lf分子量約為80000u，多肽鏈上有兩條糖鏈，包括半乳糖甘露糖N一乙酞半乳糖胺、巖藻糖以及涎酸等。由于Lf具有一些非凡的生理功能作用，能夠促進鐵吸收、廣譜抗菌、免疫增強、抗病毒、抗癌等，所以應(yīng)用高新技術(shù)對Lf的進行分離、純化和綜合利用的研究，成為食品界和乳品行業(yè)關(guān)心的熱點問題。

人們采用各種各樣的方法來分離提純Lf，例如鹽析和有機溶劑法、超濾法、離子交換色譜法、親和色譜法、吸附色譜法、固定化單克隆抗體法和混合模式擴張床吸附法等等。

1 鹽析和有機溶劑法

根據(jù)蛋白等電點沉淀原理，Lf等電點為7.8～8.0，由于各種蛋白等電點范圍交叉分布，所以很難將一種蛋白完全沉淀析出。曲練達等[1]用兩次（NH4）2SO4和一次乙醇沉淀分離純化Lf，純度達45%左右。鄔向東等[2]以飽和（NH4）2SO4鹽析分離，經(jīng)Sephadex G-100葡聚糖凝膠過柱純化，并利用聚乙二醇濃縮獲得了Lf。鹽析法比色譜法簡單，易于操作，且成本較低，但此方法得率低，產(chǎn)品純度不高。但適用于保健品和食品添加劑等純度要求不高的行業(yè)。

2 超濾法

根據(jù)膜孔徑不同來實現(xiàn)不同分子質(zhì)量和形狀的大分子的分離。日本學者島崎敬選用孔徑分別為l0PS、30PS、50PS、l00PS、300PS、1000PS和3000PS的七種系列超濾膜膜，以干酪乳清為原料，先截留小分子量，再截留大分子量，其分子量分別為104、3×104、5×104、105、3×105、106、3×106，生產(chǎn)Lf基料的回收率為69%。盧蓉蓉等[3]用超濾法從初乳中初步分離得質(zhì)量分數(shù)為26%的Lf粗品，雖適合大規(guī)模生產(chǎn)，但還無法提取高純度的Lf。為強化傳質(zhì)和分離過程，Brisson等[4]在分離過程中添加了一個外加電場強化膜通量，降低膜污染，可用于組分復(fù)雜的料液。Ndiaye等[5]用電場強化的超濾膜過濾分離Lf，但其中含有β-乳球蛋白等雜蛋白，產(chǎn)品純度不高，需進一步純化。超濾法不加熱或不發(fā)生相變，適合熱敏性功能性組分的分離。操作簡便，費用相對較低，易于形成工業(yè)化規(guī)模，是生產(chǎn)食品用乳鐵蛋白最具實現(xiàn)工業(yè)化潛力的方法之一。但純度不如色譜法高，且膜孔堵塞需經(jīng)常清洗，且不易清洗。

3 離子交換色譜法

3.1 傳統(tǒng)離子交換色譜法

根據(jù)離子交換劑對不同離子或化合物的結(jié)合力不同實現(xiàn)物質(zhì)分離，結(jié)合力的大小由離子交換劑決定。Grove使用DEAE纖維素陰離子交換樹脂和磷脂纖維素交換色譜法分離出較純的Lf。由Foley等[6]用羧甲基陽離子交換色譜法對此法加以改進，用pH值為7.7，濃度為0.05 mol/L磷酸鈉或濃度為0.3 mol/L的NaCl洗脫液，把Lf分為a，b兩種變異體，純度為81%左右。樹脂可用0.2 mol/LNaOH和0.2 mol/LHCI再生。徐麗萍[8]用Sephadex C-100柱，分別用含0.65 mol/LNaCl7.0，7.2，7.4和7.6的PBS緩沖液洗脫，得純度為92%Lf。Maharjan等[7]用一種溫度敏感型陽離子交換樹脂，在50 ℃對Lf的最大吸附容量是20 ℃的3倍，通過調(diào)節(jié)溫度選擇性洗脫Lf。傳統(tǒng)離子交換樹脂雖然成本相對較低，但分辨率也較低，要得到高純度的Lf需復(fù)雜分離工藝。

3.2 新型離子交換法

SPEC70SLS離子交換樹脂是丙烯酸共聚合物，由一個AMPS（丙烯酰胺甲基-丙烷磺酸）多聚物和一個雙功能試劑MBS（N，N-甲烷-雙-丙烯酰胺）交聯(lián)組成，擁有大孔通透性，能滿足大面積表面接觸和有效物質(zhì)傳送，實現(xiàn)蛋白的分離純化，合成樹脂可以數(shù)千次地重復(fù)使用。樹脂吸附牛脫脂乳中的Lf可用330 mMNaCl洗脫，吸附容量為8.34 mg/g，純度為96.7%，樹脂對Lf的回收率為74.50%。SPEC70 SLS樹脂被美國FDA認可為能與食品接觸的物質(zhì)，在工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模中具有巨大應(yīng)用潛力。張振字等[9]采用強陽離子交換色譜梯度洗脫法，對牛乳中的乳鐵蛋白進行分離和純化。可較好地分離提取出乳鐵蛋白，并利用SDS—PAGE定測分離出的乳鐵蛋白顯示為單一區(qū)帶，每毫升牛乳能提取乳鐵蛋白0.23 mg，純度為95%。

4 親和色譜法

4.1 傳統(tǒng)親合色譜法

Chen等[10]研究發(fā)現(xiàn)PGMA-肝磷脂超順磁均勻分散微球能夠高效的捕獲酸乳清中的Lf，吸附量達164 mg/g樹脂且純度高于Lf標準品。親合色譜法操作簡單、分離效果非常好、獲得的產(chǎn)品純度極高，且沒有生物活性損失，是生產(chǎn)醫(yī)藥用高純度Lf最有效的方法之一，但是其操作成本昂貴。限制了其在工業(yè)化生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。

4.2 新型親和色譜法

一般結(jié)構(gòu)是不容基質(zhì)…連接物…隔離臂…連接物…配體，基質(zhì)多用瓊脂糖，隔離臂多為有一定長度且可連接基質(zhì)的有機物如NH2—（CH2）n—NH2。林成招等[11]人用肝素瓊脂糖色譜柱，填料為肝素與瓊脂糖交聯(lián)的產(chǎn)物。先用PBS洗脫至吸光值基線平穩(wěn)后，分別用含0.1，0.3，0.5和1 mol/LNaCl的PBS洗柱，紫外分光光度計測得Lf純度為90.02%。也可以首先從脫脂乳中萃取到神經(jīng)節(jié)糖苷制成溶血衍生物，共價偶合于丁二酸化玻璃珠上，再利用固定化的神經(jīng)節(jié)基質(zhì)親和吸附Lf，最后用緩沖液洗脫。此法可從廉價的乳清中大量制備Lf，方法簡單，易于擴大規(guī)?？蓪崿F(xiàn)工業(yè)化。

5 吸附色譜法

利用固定基質(zhì)和吸附物質(zhì)問物理或化學吸附強度的不同來分離物質(zhì)，使用顆粒狀吸附劑的表面存在著許多隨機分布的吸附位點，通過范德瓦爾引力和靜電引力與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，其結(jié)合力大小與各種生物分子的結(jié)構(gòu)和吸附劑的性質(zhì)有關(guān)。一般以Toyopearl為基質(zhì)，在（NH4）2SO4溶液中達到吸附平衡后裝柱，用去離子水、0.25 mol/LHAc和0.2 mol/L NaOH洗脫，得到純度為80%的Lf，其缺點是吸附容量小、效率低。傅維琦等[12]利用CM-SAPHAROSE FastFlow裝柱，對脫脂牛初進行兩步階躍洗脫獲得高純度洗脫液，但此法成本較高，大大限制了分離工藝的工業(yè)化。

6 固定化單克隆抗體法

利用抗原-抗體之間的高特異性結(jié)合反應(yīng)而實現(xiàn)目標物的分離。在6～8周的鼠腹中注入人或牛的乳鐵蛋白進行免疫，經(jīng)一系列分離出抗體，用抗體和異丙醇活化的親合凝膠混合制得免疫親合色譜。用脫脂牛初乳或常乳作為料液，用洗脫0.2 mol/LpH2.7醋酸緩沖液（含0.15 mol/LNaCI）洗脫，分離脫脂人初乳Lf純度98%，分離脫脂牛乳Lf純度97%。該法較成功的實現(xiàn)了Lf的一步分離，分離效果好純度高，抗體被固定可重復(fù)使用，但是柱的制備工藝復(fù)雜，抗體成本昂貴，難以工業(yè)化生產(chǎn)。

7 混合模式擴張床吸附法

功能配基含有疏水和離子交換基團，兼具疏水和靜電作用，通過靜電相吸強化吸附或靜電排斥協(xié)助解吸。同時配基密度比較高，有典型的耐鹽吸附性，可以從較低濃度的體系中富集目標蛋白。將擴張床吸附和混合模式吸附層析有機結(jié)合充分發(fā)揮二者優(yōu)勢，實現(xiàn)混合模式擴張床吸附，達到低原料、高處理量和高選擇性的分離目標。林東強等[14]采用混合模式擴張床吸附介質(zhì)Streamline Direct HST的擴張床膨脹特性和流體混合性能好，膨脹率為2滿足高處理量和床層穩(wěn)定性的要求，該介質(zhì)對Lf的吸附容量較大約為110 mg/g介質(zhì)，具有一定的耐鹽特性，采用pH值階躍洗脫，20 mmol/LNaOH洗脫直接從牛乳清中得到Lf收率為87.8%。

8 各種分離技術(shù)綜合運用

蔣超等[15]采用超濾、陽離子交換層析方法從干酪乳清中分離純化乳鐵蛋白。經(jīng)預(yù)處理后的干酪乳清加入經(jīng)過磷酸鹽緩沖液（pH值為8.0）平衡的樹脂中，分別用0.3 mol/L和0.8 mol/L的Nacl進行階躍洗脫，純度達93.6%。紀長謹?shù)萚16]試驗通過等電沉淀、鹽析和層析分離等方法從牛初乳中分離Lf，并用SDS-PAGE、Western Blot檢測和鑒定，Lf其純度>90%，方法簡便、經(jīng)濟、安全，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。

高純度和高效的蛋白分離純化需各種分離技術(shù)的結(jié)合，許多具體問題有待解決?？傊S著高新技術(shù)的廣泛應(yīng)用，能夠?qū)崿F(xiàn)降低Lf的制造成本，完善工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)和高效性的商品化工藝條件。

參考文獻

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