蕓香苷-羧甲基-β-環(huán)糊精包合物的制備及其表征

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(1.湖南省煙草科學(xué)研究所,湖南長(zhǎng)沙 410007; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128)

蕓香苷-羧甲基-β-環(huán)糊精包合物的制備及其表征

陳筠1,2,許詩(shī)豪2,羅井清1,楊紅武1,彭曙光1,*,王征2,*

(1.湖南省煙草科學(xué)研究所,湖南長(zhǎng)沙 410007; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128)

以包埋率為評(píng)價(jià)指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)蕓香苷-羧甲基-β-環(huán)糊精包合物制備工藝條件進(jìn)行優(yōu)化并進(jìn)一步用紅外光譜、掃描電鏡等方法對(duì)包合物進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明蕓香苷-羧甲基-β-環(huán)糊精包合物最佳制備工藝條件為包埋質(zhì)量比1∶4,包埋溫度60 ℃,包埋時(shí)間2 h,包埋率達(dá)62.92%,紅外光譜、掃描電鏡結(jié)果表明蕓香苷已包埋在羧甲基-β-環(huán)糊精的內(nèi)腔中。此條件下包合物的水溶解度得到明顯提高,達(dá)到1760 mg/L。本實(shí)驗(yàn)采用的包埋方法和包埋材料可以改善蕓香苷的水溶解性。

蕓香苷,羧甲基-β-環(huán)糊精,包合物,溶解度

蕓香苷又稱蘆丁(Rutin),是一種廣泛存在于食用和藥用植物的黃酮類化合物[1-2]。研究者發(fā)現(xiàn)蕓香苷具有多種生物活性和功效,如吸收紫外線、抗骨質(zhì)疏松[4]、清除自由基、抗氧化[3]、保護(hù)胃黏膜、增強(qiáng)免疫、抗衰老[5]、降低血糖、抗癌細(xì)胞[6]、抗病毒、抑菌、抗炎、鎮(zhèn)痛等[7],在食品和藥品等工業(yè)中具有良好的應(yīng)用前景。但蕓香苷的水溶性極差,限制了其在食品、藥物、化妝品等行業(yè)中的廣泛應(yīng)用。若對(duì)蕓香苷進(jìn)行改性,增加其水溶性,可提高很多植物資源的經(jīng)濟(jì)附加值,提高生物利用度。

β-CD分子呈中空筒狀,圓筒外側(cè)分布大量羥基決定了其良好的水溶性,而圓筒內(nèi)側(cè)的非極性基團(tuán)則在環(huán)糊精內(nèi)部形成了一個(gè)疏水環(huán)境,它的疏水區(qū)可以與各種有機(jī)化合物發(fā)生作用,形成新的復(fù)合物,并且化合物的物理化學(xué)性質(zhì)并未被改變[8]。若在β-環(huán)糊精中引入羧甲基,羧甲基的氧能與水分子的氫形成氫鍵,可以得到水溶性更好的羧甲基-β-環(huán)糊精[9-10]。目前,有一些關(guān)于利用β-CD及衍生物包埋木犀草素等活性物質(zhì)的研究報(bào)道[11-13],包埋物仍然能較好地保持生物活性,這些研究為活性成分的有效應(yīng)用提供了有意義的參考工藝和數(shù)據(jù)。而蕓香苷和羧甲基-β-環(huán)糊精(carboxymethyl-β-cyclodextrin,CM-β-CD)之間相互作用還沒有文獻(xiàn)報(bào)道,所以本研究選取溶解度更好的CM-β-CD為壁材,對(duì)蕓香苷進(jìn)行包埋工藝條件研究,使其溶解度明顯增加,擬進(jìn)一步尋找蕓香苷在功能食品應(yīng)用中的新途徑。

1 材料和方法

1.1材料和儀器

蕓香苷 國(guó)藥基團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;羧甲基-β-環(huán)糊精 上海伊卡生物技術(shù)有限公司;甲醇、乙腈 德國(guó)默克公司;無(wú)水乙醇 安徽安特食品股份有限公司。

安捷倫1260高效液相色譜儀、ZORBAX SB-C18色譜柱 美國(guó)Agilent公司;數(shù)學(xué)控溫電熱攪拌器 天津泰斯特儀器有限公司;VECTOR-22型傅立葉紅外光譜儀 德國(guó)布魯克公司;S-3700掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取10 mg蕓香苷加入到25 mL容量瓶中用80%乙醇定容得到標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別取0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.8,1.0 mL于10 mL容量瓶中,用80%乙醇定容,搖勻,用高效液相色譜法繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 蕓香苷/CM-β-CD包合物制備 精密稱取適量的蕓香苷置于錐形瓶中,向其中加入乙醇溶液,超聲使其完全溶解。按蕓香苷與CM-β-CD的一定質(zhì)量比稱取CM-β-CD,并加水使其溶解。將CM-β-CD水溶液緩慢滴加入蕓香苷-乙醇溶液中,在一定溫度下,電熱攪拌器攪拌一段時(shí)間,自然降溫后繼續(xù)攪拌,得到懸液,將懸液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇后,得到的液體放入真空冷凍干燥機(jī)中干燥,得到包合物固體[14-15]。

1.2.3 包合物中蕓香苷含量的測(cè)定 蕓香苷含量測(cè)定采用高效液相色譜法。稱取50 mg包合物,加入80 mL 50%乙醇溶解,電磁攪拌1 h,靜置,得淡黃色液體。根據(jù)下式計(jì)算包埋率:

包埋率(%)=(包合物中蕓香苷的量/投入到包埋反應(yīng)體系中的蕓香苷的量)×100

1.2.4 包合物的溶解度測(cè)定 稱取100 mg的蕓香苷和蕓香苷/CM-β-CD包合物,分別用100 mL水溶解,搖床振蕩72 h制成過(guò)飽和溶液,0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,取濾液稀釋適當(dāng)倍數(shù),用高效液相色譜法測(cè)蕓香苷的含量,再計(jì)算蕓香苷的溶解度[16]。

1.2.5 紅外光譜檢測(cè) 分別取10 mg的蕓香苷,CM-β-CD及蕓香苷/CM-β-CD包合物,用KBr壓片,于400～4000 cm-1范圍進(jìn)行紅外光譜分析。

1.2.6 掃描電鏡 分別取10 mg的蕓香苷,CM-β-CD,蕓香苷和CM-β-CD的物理混合物,蕓香苷/CM-β-CD包合物進(jìn)行掃描電鏡分析。

1.2.7 包埋工藝條件的優(yōu)化 包埋質(zhì)量比的影響:以包埋率為評(píng)價(jià)指標(biāo),在包埋溫度60 ℃、包埋時(shí)間2 h和乙醇濃度80%的條件下考察不同包埋質(zhì)量比(1∶1、1∶2、1∶4、1∶6)對(duì)包埋率的影響。

乙醇濃度的影響:以包埋率為評(píng)價(jià)指標(biāo),在包埋質(zhì)量1∶4,在包埋溫度60 ℃,包埋時(shí)間2 h的條件下,考察不同乙醇濃度(60%、70%、80%、90%)對(duì)包埋率的影響。

包埋時(shí)間的影響:以包埋率為評(píng)價(jià)指標(biāo),在最適質(zhì)量比1∶4和乙醇濃度80%,在包埋溫度60 ℃條件下,考察不同包埋時(shí)間(1、2、3、4 h)對(duì)包埋率的影響。

包埋溫度的影響:以包埋率為評(píng)價(jià)指標(biāo),包埋時(shí)間2 h、包埋質(zhì)量比1∶4、乙醇濃度80%的條件下,考察不同包埋溫度(50、60、70、80 ℃)對(duì)包埋率的影響。

響應(yīng)面分析:由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果中選擇包埋溫度,包埋時(shí)間,包埋質(zhì)量比三個(gè)對(duì)包埋率影響較大的因素作為研究參數(shù),分別用A、B、C表示,比包埋率為響應(yīng)值(Y%),進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì),應(yīng)用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理對(duì)蕓香苷-CM-β-CD包合物制備工藝進(jìn)行優(yōu)化[17-18]。

1.3數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次取平均值,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,通過(guò)SPSS 19.0軟件進(jìn)行比較分析,采用單因素方差分析組間差異(One-way ANOVA,LSD),p<0.05表示有顯著性差異,p<0.01表示顯著性差異極大。

2 結(jié)果和討論

2.1蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按1.2.1可以得到蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=43.499x+289.61,R2=0.9988,如圖1所示,蕓香苷在20～200 μg/mL濃度內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of rutin

2.2包合物制備工藝的優(yōu)化

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由圖2可看出,質(zhì)量比為1∶4時(shí),包埋率達(dá)到最大值,且與其它質(zhì)量比相比有顯著性差異(p<0.05),這可能是由于CM-β-CD的內(nèi)腔有一定的空間[19],可以通過(guò)羥基與蕓香苷上的活潑基團(tuán),如酚羥基或氫原子之間發(fā)生相互作用(見圖9包合物的紅外光譜酚羥基峰信號(hào)減弱)[20],在一定比例下,蕓香苷進(jìn)入CM-β-CD分子空穴,隨其濃度增加會(huì)達(dá)到飽和狀態(tài),此時(shí)包埋率最大為61.11%。與CM-β-CD比較,如果蕓香苷相對(duì)比例高,多余的蕓香苷進(jìn)入不了空穴,只能附著于包埋劑,容易離解。所以,我們推測(cè) 在1∶1或1∶2比例下,蕓香苷比例相對(duì)較高,1∶6比例下,CM-β-CD空穴沒有被飽和,1∶4比例下,包埋率最佳,說(shuō)明此時(shí)兩者相對(duì)濃度適合較適包埋比例。圖3可看出,乙醇濃度為80%時(shí),與其他乙醇濃度相比,包埋率的差別不大,說(shuō)明四種乙醇濃度對(duì)包埋率的影響無(wú)明顯差異(p>0.05),但由于乙醇濃度80%時(shí)蕓香苷溶解效果好,且相對(duì)于乙醇濃度90%來(lái)說(shuō),節(jié)省乙醇,故選擇乙醇濃度80%;圖4可看出,包埋時(shí)間為2 h時(shí),包埋率達(dá)到最大值59.56%,且與其它包埋時(shí)間相比有顯著性差異(p<0.05),這可能是由于包埋時(shí)間的加長(zhǎng)有利于包埋過(guò)程,但包埋時(shí)間過(guò)長(zhǎng),蕓香苷的穩(wěn)定性受到影響,降低了包埋率,故選擇包埋時(shí)間2 h;由圖5可看出,包埋溫度為60 ℃時(shí),包埋率達(dá)到最大值62.92%,且與其它包埋溫度相比有顯著性差異(p<0.05),這可能是由于溫度升高有利于反應(yīng)的進(jìn)行,但溫度過(guò)高,也加速了蕓香苷從包埋物中釋放，不利于其穩(wěn)定性,且溫度過(guò)高會(huì)消耗能量,故選擇包埋溫度60 ℃。

圖2 質(zhì)量比對(duì)包合物包埋率的影響Fig.2 Effect of mass ratio on the inclusion rate

圖3 乙醇濃度對(duì)包合物包埋率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the inclusion rate

圖4 包埋時(shí)間對(duì)包合物包埋率的影響Fig.4 Effect of time on the inclusion rate

圖5 包埋溫度對(duì)包合物包埋率的影響Fig.5 Effect of temperature on the inclusion rate

2.2.2 BBD-RSM實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及顯著性分析 利用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)原則,選取三個(gè)對(duì)包合物包埋率影響顯著的三個(gè)因素質(zhì)量比,包埋溫度,包埋時(shí)間,采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法對(duì)工藝方法進(jìn)行優(yōu)化。BBD方案結(jié)果見表1。

方差分析結(jié)果見表2。對(duì)各因素與響應(yīng)值進(jìn)行回歸擬合得到模型對(duì)應(yīng)的回歸方程是y=63.03+0.39A+0.64B+0.39C+0.37AB+1.53AC+0.94BC+2.24A2+2.11B2-1.87C2

表1 BBD方案和結(jié)果Table 1 BBD matrix and results

表2 方差分析Table 2 Variance analysis

注：*表示p<0.05為顯著;**表示p<0.01為極顯著。

由表2可以看出,模型p<0.01,表明回歸方差模型極顯著,該實(shí)驗(yàn)方法可靠,失擬項(xiàng)p=0.6047>0.05,不顯著,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所得的回歸方程能夠很好的對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)回歸方程各項(xiàng)的方差系數(shù)可以看出,B,AC,BC,A2,B2,C2為差異極顯著(p<0.01),C有顯著差異(p<0.05),說(shuō)明它們對(duì)影響值影響大,而其他變量的影響或交互影響都不顯著(p>0.05)。

2.2.3 包埋工藝條件的響應(yīng)面分析與優(yōu)化 通過(guò)軟件處理,得到三因素包埋溫度(A),包埋時(shí)間(B),包埋質(zhì)量比(C)交互作用的響應(yīng)面及等高線圖,圖6～圖8分別是固定其中一個(gè)因素,考察另外兩個(gè)因素對(duì)包埋率的影響的響應(yīng)面圖,可直觀的反映任意兩個(gè)因素之間的相互作用及其對(duì)響應(yīng)值(Y%)的影響。由圖可以看出,各個(gè)交互作用的因素最佳作用點(diǎn)都落在了實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),說(shuō)明這個(gè)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理。兩個(gè)因素之間的交互作用可以清晰的反映包埋率(Y%)隨著二元變量在三維空間上的變化情況,利用所得信息我們可以從理論上來(lái)對(duì)實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化方案解釋。通過(guò)方程中的偏回歸系數(shù)顯著性分析可得,包埋質(zhì)量比和包埋溫度,包埋質(zhì)量比和包埋時(shí)間相互作用影響大(p<0.01),而包埋時(shí)間和包埋溫度相互作用影響不大(p>0.05),與之前的方差分析結(jié)果一致。

圖6 包埋時(shí)間和包埋溫度交作影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour line of inclusion time and temperature

圖7 質(zhì)量比和包埋溫度交作影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour line of inclusion temperature and mass ratio

圖8 質(zhì)量比和包埋時(shí)間交作影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.8 Response surface and contour line of inclusion time and mass ratio

通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert 7.1.6,依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選取的對(duì)包合物包埋率影響較顯著因素依次為包埋溫度、包埋時(shí)間、包埋質(zhì)量比,選取3因素的最佳水平范圍,應(yīng)用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理對(duì)蕓香苷包埋工藝進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明:此時(shí)最佳工藝條件為,包埋溫度(X1)=59.34 ℃,包埋時(shí)間(X2)=120.78 min,包埋質(zhì)量比(X3)=0.25,包埋率(Y)的最大預(yù)測(cè)值為62.73%。實(shí)際操作條件為:包埋溫度(X1)=60 ℃,包埋時(shí)間(X2)=120 min,包埋質(zhì)量比(X3)=0.25,在這個(gè)條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到包埋率為62.92%,得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果十分吻合,優(yōu)化效果顯著,且回歸模型有效可靠。

2.3紅外光譜

分別測(cè)定蕓香苷、包合物、環(huán)糊精單體的紅外光譜,結(jié)果如圖9所示,圖中的a為蕓香苷的紅外光譜圖,在3422 cm-1處是蕓香苷羥基的伸縮振動(dòng)峰,在2939 cm-1處是-CH2的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰,在1655 cm-1處是α、β不飽和酮C=O的伸縮振動(dòng)峰,而在1600～1400 cm-1是苯環(huán)的伸縮振動(dòng)峰,在1063 cm-1則是-C-O-C的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰。圖中的c是CM-β-CD的紅外光譜圖,在3336 cm-1是其羥基的伸縮振動(dòng)峰,在2928 cm-1是糖環(huán)骨架上的C-H伸縮振動(dòng)峰,在1028 cm-1處是-C-O-C的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰,在1420、1617 cm-1出現(xiàn)了羧甲基的特征峰,圖中的b則為蕓香苷-β-CD包合物的紅外光譜圖,可以看出來(lái)包合物與環(huán)糊精的紅外光譜非常相似,只是蕓香苷在500～1500 cm-1之間的一些小的吸收峰(1050.7、1203.5、1298.6 cm-1),表示酚羥基、Ar-O-R的基團(tuán)特征峰在包合物的紅外光譜中信號(hào)減弱或消失,說(shuō)明這些基團(tuán)幾乎被環(huán)糊精掩蓋。包合物有新的峰生成,也有峰的消失。這說(shuō)明了蕓香苷包進(jìn)了CM-β-CD空腔中,而且包合作用過(guò)程是一個(gè)物理過(guò)程,主要作用是范德華力等,沒有新化學(xué)鍵的形成,沒有發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。

圖9 樣品紅外光譜Fig.9 FTIR spectra of samples注：a. 蕓香苷,b.包含物,c. CM-β-CD。

2.4掃描電鏡分析

如圖10A所示為CM-β-CD單體的電鏡掃描結(jié)構(gòu)圖,可以看出CM-β-CD單體是個(gè)體單獨(dú)存在的,形狀為片狀。如圖10B所示為蕓香苷單體的電鏡掃描結(jié)構(gòu)圖,可以看出蕓香苷單體是呈球狀的,或單獨(dú)或成簇存在的。由圖10C所示的蕓香苷和 CM-β-CD的物理混合物掃描結(jié)構(gòu)圖可以看出,混合物中既具有球狀蕓香苷形態(tài),又有CM-β-CD的晶型,說(shuō)明兩者之間未發(fā)生包合。從圖10D所示的蕓香苷-CM-β-CD包合物的電鏡掃描結(jié)構(gòu)圖可以看出包合物中蕓香苷被包裹在CM-β-CD的內(nèi)部,幾乎看不到蕓香苷的形態(tài)。說(shuō)明蕓香苷通過(guò)疏水作用以分子的形式進(jìn)入CM-β-CD空腔,失去了蕓香苷的形態(tài)。

2.5溶解度測(cè)定

在最優(yōu)條件下制備蕓香苷/CM-β-CD包合物,得到的包埋率為62.92%,溶解度為1760 mg/L,而純蕓香苷在水中的溶解度僅為50.34 mg/L,可見形成包合物后,蕓香苷在水中的溶解度明顯增加。

3 結(jié)論

蕓香苷藥理活性強(qiáng),在植物界中廣泛存在,但蕓香苷溶水性差等缺點(diǎn)限制了其使用和發(fā)展。近年來(lái),隨著技術(shù)的進(jìn)步,對(duì)蕓香苷的改性研究有很多有意義的結(jié)果,這無(wú)疑提高了蕓香苷的生物利用度[21-22]。邵偉等[16]用β-環(huán)糊精包埋蕓香苷得到了溶解度增加13倍左右的包合物。艾鳳偉等[8]用二甲基-β-環(huán)糊精包埋蕓香苷得到了溶解度增加了14倍左右的包合物。本實(shí)驗(yàn)采用的是水溶性比β-環(huán)糊精和二甲基-β-環(huán)糊精更好的CM-β-CD,而且無(wú)毒無(wú)害,蕓香苷用乙醇溶解而不是甲醇,通過(guò)溶液攪拌法制得的包合物溶解度比蕓香苷單體溶解度增加了35倍左右。本實(shí)驗(yàn)將蕓香苷、CM-β-CD、蕓香苷-CM-β-CD包合物的紅外光譜和電鏡掃描圖像進(jìn)行了比較,驗(yàn)證了蕓香苷已經(jīng)包埋進(jìn)環(huán)糊精的內(nèi)腔中。研究結(jié)果為蕓香苷水溶性改性和有效利用提供了有意義的參考數(shù)據(jù)。

蕓香苷來(lái)源豐富,除了槐花等植物,很多農(nóng)產(chǎn)品廢棄物中蕓香苷的含量也很高,例如煙草、蔬果加工廢棄物等[23-25]。將蕓香苷制成糊精包合物可極大增加蕓香苷溶解度,對(duì)于廢棄農(nóng)產(chǎn)品的合理利用和開發(fā),增加其經(jīng)濟(jì)附加值,節(jié)省自然資源有著積極的意義。

圖10 樣品的掃描電鏡Fig.10 SEM of samples

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Preparationandcharacterizationoftherutin-CM-β-CDinclusioncomplex

CHENYun1,2,XUShi-hao2,LUOJing-qing1,YANGHong-wu1,PENGShu-guang1,*,WANGZheng2,*

(1.Research Institute of Hunan Tobacco Science,Changsha 410007,China; 2. College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural Universtity,Changsha 410128,China)

Based on the single factor experiments,the response surface methodology was utilized to obtain the optimum conditions by studying the factor of mass ratio,embedding temperature,embedding time with the embedding rate as the evaluation index,and rutin-CM-β-CD inclusion complex was identified by Sanning Electronic Microscopy(SEM),FI-IR. The rusults showed that the optimum ratio of Rutin and CM-β-CD was 1∶4,the embedding temperature was 60 ℃,the embedding time was 2 h,and the embedding rate was 62.92%. The results of SEM,FI-IR showed that rutin was contained in the inner cavity of CM-β-CD. Under these conditions,the solubility of inclusion complexes was about 1760 mg/L. The embedding method and material used in experiment could improve the solubility of rutin.

rutin;CM-β-CD;inclusion complex;solubility

2017-03-29

陳筠(1993-),女,碩士研究生,研究方向:天然產(chǎn)物的開發(fā)與利用,E-mail:714852160@qq.com。

*

彭曙光(1973-),男,博士,高級(jí)農(nóng)藝師，研究方向:煙草科學(xué)與資源開發(fā),E-mail:199166853@qq.com。 王征(1967-),女,博士,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向:食物營(yíng)養(yǎng)與藥理,E-mail:wz8918@163.com。

中國(guó)煙草總公司湖南省公司科技項(xiàng)目(15-17Aa04)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)21-0197-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.039