大戟科Lhcb基因家族的全基因組鑒定、分類與進(jìn)化分析

鄒 智，安 鋒，楊禮富，王真輝，袁 坤

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所 農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737)

大戟科Lhcb基因家族的全基因組鑒定、分類與進(jìn)化分析

鄒 智，安 鋒，楊禮富，王真輝，袁 坤

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所 農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737)

基于已公布的基因組和EST數(shù)據(jù)，研究對(duì)蓖麻、麻瘋樹、木薯和橡膠樹4種大戟科植物的Lhcb基因家族進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，并在此基礎(chǔ)上分析其基因結(jié)構(gòu)與進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明，蓖麻、麻瘋樹、木薯和橡膠樹分別含有10、10、13和15個(gè)Lhcb基因，分屬于Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4、Lhcb5、Lhcb6、Lhcb7和Lhcb8等8個(gè)亞家族，每個(gè)亞家族包含1～4個(gè)成員不等，基因的內(nèi)含子數(shù)目在0～5個(gè)之間，部分基因還存在可變剪接形式。進(jìn)化分析顯示，Lhcb1、Lhcb4、Lhcb5和Lhcb7亞族早于單細(xì)胞的藻類中就已產(chǎn)生，Lhcb3和Lhcb6亞族在光合生物向陸地進(jìn)化后產(chǎn)生，Lhcb2亞族存在于高等植物中，Lhcb8亞族則為雙子葉植物所特有；Lhcb1亞族在所分析的4種大戟科植物中均出現(xiàn)了基因擴(kuò)增，Lhcb2和Lhcb5亞族在木薯和橡膠樹中出現(xiàn)了擴(kuò)增，而Lhcb3和Lhcb6亞族僅在橡膠樹中出現(xiàn)了擴(kuò)增。

大戟科植物；全基因組；Lhcb基因家族；鑒定；分類；進(jìn)化分析

LHCΙΙ（light-harvesting chlorophyll a/b-binding proteins of photosystem ΙΙ）是植物光系統(tǒng) ΙΙ（PSΙΙ）中與色素分子結(jié)合的一系列膜蛋白，由Lhcb基因家族編碼，含有保守的葉綠素結(jié)合（chlorophyllbinding, CB）結(jié)構(gòu)域，它們除進(jìn)行光能的捕獲與傳遞外，還廣泛參與了激發(fā)能在PSΙ和PSΙΙ之間的調(diào)節(jié)與分配、類囊體膜結(jié)構(gòu)的維持、光保護(hù)以及對(duì)各種環(huán)境的應(yīng)答等過程[1-5]。雖然Lhcb基因家族已在擬南芥Arabidopsis thaliana、水稻Oryza sativa、楊樹Populus trichocarpa等模式植物中得到了系統(tǒng)鑒定，并分為Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4、Lhcb5、Lhcb6、Lhcb7和 Lhcb8等 8個(gè)亞家族[6-8]，但在以高光效和高生物量著稱的大戟科（Euphorbiaceae）植物中，至今還未見Lhcb類基因的報(bào)道。研究基于蓖麻Ricinus communis、麻瘋樹Jatropha curcas、木薯Manihot esculenta、橡膠樹Hevea brasiliensis 等4種大戟科植物最新釋放的全基因組序列[9-14]，對(duì)其Lhcb基因進(jìn)行了全面鑒定，并在此基礎(chǔ)上分析了其基因的結(jié)構(gòu)、編碼蛋白的生化特性及進(jìn)化關(guān)系，以期為下一步的功能研究與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii、小立碗蘚Physcomitrella patens、擬南芥、水稻、蓖麻、木薯的全基因組序列下載于phytozome v9.0（http∶//www.phytozome.net/）；麻瘋樹和橡膠樹的全基因組序列，蓖麻、麻瘋樹、木薯和橡膠樹的cDNA與 EST 序 列 下 載 于 NCBΙ（http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

1.2 方 法

1.2.1 蓖麻、麻瘋樹、木薯和橡膠樹 Lhcb基因的鑒別與分類

根據(jù)先前的研究結(jié)果[6-8,15-16]，首先從萊茵衣藻、小立碗蘚、水稻和擬南芥的基因組中調(diào)取了已報(bào)道的Lhcb基因，然后從每個(gè)亞家族中選取1個(gè)成員作為查詢序列，采用tBLASTn程序[17]（E值設(shè)為10-5）分別搜索萊茵衣藻、小立碗蘚、水稻和擬南芥的基因組，蓖麻、麻瘋樹、木薯和橡膠樹的基因組、cDNA及EST序列，候選基因翻譯成蛋白后再確認(rèn)其是否存在跨膜螺旋和CB結(jié)構(gòu)域。

1.2.2 蓖麻、麻瘋樹、木薯和橡膠樹 LHCΙΙ的生化特性、進(jìn)化分析及系統(tǒng)命名

采用在線軟件 ProtParam（http∶//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測蛋白的理論分子量（molecular weight, Mw）、等電點(diǎn) (theoretical pΙ)、總平均親水 性（grand average of hydropathy, GRAVY）；采用在線軟件ChloroP軟件（http∶//www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）預(yù)測蛋白的信號(hào)肽。用ClustalW2[18]進(jìn)行多序列比對(duì)后，運(yùn)用MEGA 4.0（http∶//megasoftware.net）[19]采 用 Neighbor-Joing法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，bootstrap值設(shè)為1 000；最后遵循擬南芥中的命名規(guī)則及進(jìn)化關(guān)系對(duì)基因和蛋白進(jìn)行系統(tǒng)命名。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓖麻、麻瘋樹、木薯和橡膠樹Lhcb基因的鑒別與分類

綜合同源搜索及已報(bào)道的研究結(jié)果，分別從萊茵衣藻、小立碗蘚、水稻和擬南芥的基因組中鑒定出12、23、9和15個(gè)Lhcb基因，其中Cre02.g110750.t1.2為本研究首次鑒定，鑒于它與擬南芥的Lhcb7同源（蛋白水平的相似性高達(dá)51%），將其命名為CrLhcb7（表1）。

表1 萊茵衣藻、小立碗蘚、水稻和擬南芥基因組中鑒定的Lhcb基因Table 1 List of Lhcb genes identified from genome of Creinhardtii, moss, Arabidopsis and rice

綜合同源搜索和CB結(jié)構(gòu)域分析，研究分別從蓖麻、麻瘋樹、木薯和橡膠樹的基因組和EST序列中鑒定出10、10、13和15個(gè)Lhcb基因，分 屬 于 Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4、Lhcb5、Lhcb6、Lhcb7和Lhcb8等8個(gè)亞家族（表2）。

從基因結(jié)構(gòu)來來看，這些基因包含0～5個(gè)內(nèi)含子不等，除Lhcb5亞族外，同一亞族的基因具有相同的內(nèi)含子數(shù)目，如Lhcb1亞族基因都無內(nèi)含子，Lhcb2、Lhcb4、Lhcb6和Lhcb8亞族基因都含有1個(gè)內(nèi)含子，Lhcb3亞族基因都含有2個(gè)內(nèi)含子，Lhcb7亞族基因都含有5個(gè)內(nèi)含子?；蚓幋a區(qū)長度在507～3 950 bp之間，cDNA編碼區(qū)長度在 507 ～ 1 014 bp 之間（表 2）。

表2 蓖麻、麻瘋樹、木薯和橡膠樹基因組中鑒定的Lhcb基因Table 2 List of Lhcb genes identified from genome of Castor bean, Physic nut, Cassava and Rubber tree

從基因分布來看，在4個(gè)物種中，不同亞族的基因都散布于不同的scaffold上，而對(duì)于同一亞族的基因，木薯和橡膠樹中多數(shù)位于相同的scaffold上（表2）。

從EST分布來看，蓖麻所有的Lhcb基因在NCBΙ中都存在EST，麻瘋樹和木薯中分別有80%和92.31%的基因存在EST，而橡膠樹中只有6.67%的基因存在EST。此外，目前的EST數(shù)據(jù)顯示，蓖麻和木薯分別有30%和46.15%的基因存在可變剪接（表2）。

2.2 蓖麻、麻瘋樹、木薯和橡膠樹 LHCΙΙ的生化特性、進(jìn)化分析及系統(tǒng)命名

蓖麻LHCΙΙ蛋白最長的包含329個(gè)氨基酸殘基，最短的有256個(gè)殘基，其Mw值在27.40～ 36.13 kDa之 間；pI值 在 5.11～ 7.01之 間；GRAVY值在-0.146～0.123之間，其中，親水性蛋白（即GRAVY＜0）的約占50.00%；AI值在78.11～100.27之間；II值在19.42～40.54之間，不穩(wěn)定蛋白（即II＞40）約占10.00%（表3）。

麻瘋樹LHCΙ蛋白最長的包含337個(gè)氨基酸殘基，最短的有247個(gè)殘基，其Mw值在26.71～ 36.89 kDa之 間；pI值 在 4.87～ 7.67之 間；GRAVY值在-0.094～0.091之間，其中，親水性蛋白約占40.00%；AI值在79.03～101.36之間；II值在17.16～42.31之間，不穩(wěn)定蛋白約占10.00%（表3）。

木薯LHCΙ蛋白最長的包含335個(gè)氨基酸殘基，最短的有154個(gè)殘基，其Mw值在16.60到36.64 kDa之間；pI值在5.04到7.78之間；GRAVY值在-0.109到0.114之間，其中，親水性蛋白的約占38.46%；AI值在78.79到98.81之間；II值在16.56到44.86之間，不穩(wěn)定蛋白約占7.69%（表3）。

橡膠樹LHCΙ蛋白最長的包含335個(gè)氨基酸殘基，最短的有254個(gè)殘基，其Mw值在26.95～ 36.83 kDa之 間；pI值 在 5.11～ 8.94之 間；GRAVY值在-0.174～0.118之間，其中，親水性蛋白的約占33.33%；AI值在80.30～98.51之間；II值在15.09～44.40之間，不穩(wěn)定蛋白約占6.67%（表3）。

為揭示大戟科植物L(fēng)hcb基因的起源與進(jìn)化，研究用生物進(jìn)化史上的重要物種——萊茵衣藻（可進(jìn)行光合作用的單細(xì)胞生物）、小立碗蘚（早期的陸地生物）、水稻（單子葉模式植物）、擬南芥（雙子葉模式植物）與蓖麻、麻瘋樹、木薯和橡膠樹的LHCΙΙ蛋白共同構(gòu)建了進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，這些蛋白聚成4大類，即Lhcb1與Lhcb2亞族聚成1類，Lhcb4、Lhcb6與Lhcb8亞族聚成1類，Lhcb5和Lhcb7亞族聚成1類，Lhcb3單獨(dú)聚成1類（圖1）。

在由Lhcb4、Lhcb6和Lhcb8亞族聚成的大類中，蛋白以亞族為單位形成3個(gè)明顯的分支。在Lhcb4亞族中，不僅有小立碗蘚的PpLhcb4.1和PpLhcb4.2，同時(shí)還存在CrLhcb4，這表明該亞族早在單細(xì)胞的綠藻中就已經(jīng)存在，顯示出較早的起源，并且該亞族在小立碗蘚和擬南芥中都出現(xiàn)過基因擴(kuò)增。Lhcb6亞族最早出現(xiàn)在苔蘚類生物，并在小立碗蘚、木薯和橡膠樹中都出現(xiàn)過基因擴(kuò)增。Lhcb8只存在于雙子葉植物中，應(yīng)為單、雙子葉植物分化后才進(jìn)化產(chǎn)生。

在由Lhcb5和Lhcb7亞族與萊茵衣藻的CrLhcb5和CrLhcb7聚成的大類中，雖然序列比對(duì)表明CrLhcb5 和CrLhcb7在擬南芥中相似性最高的分別為AtLhcb5和AtLhcb7（其相似性分別為58.00%和51.00%，但CrLhcb5并沒有像PpLhcb5.1 和 PpLhcb5.2一樣聚入 Lhcb5分支，CrLhcb7也沒有像PpLhcb7一樣聚入Lhcb7分支。相對(duì)而言，Lhcb7亞族較為保守，在分析的所有物種中均為單拷貝，而Lhcb5亞族在小立碗蘚、木薯和橡膠樹中都出現(xiàn)過基因擴(kuò)增。

在由Lhcb1與Lhcb2亞族聚成的大類中，存在7個(gè)明顯的分支，其中，水稻、擬南芥、蓖麻、木薯和橡膠樹的Lhcb2蛋白形成1個(gè)分支，萊茵衣藻和小立碗蘚的相應(yīng)蛋白各自形成獨(dú)立的分支，擬南芥的5個(gè)Lhcb1蛋白形成1個(gè)分支，蓖麻有2個(gè)Lhcb1蛋白與水稻的Lhcb1蛋白形成1個(gè)分支，橡膠樹有2個(gè)Lhcb1蛋白形成1個(gè)分支，麻瘋樹和木薯的Lhcb1蛋白與蓖麻和橡膠樹的部分Lhcb1蛋白形成1個(gè)分支（圖1）。

Lhcb3亞族中含有1個(gè)小立碗蘚Lhcb蛋白，表明該亞族應(yīng)為光合生物向陸地進(jìn)化后產(chǎn)生，并且在后期進(jìn)化中較為保守，因?yàn)樵搧喿宄谙鹉z樹中出現(xiàn)過基因加倍外，其在小立碗蘚、水稻、擬南芥、蓖麻和木薯中均為單拷貝。

圖1 LHCΙ蛋白的進(jìn)化分析Fig. 1 Phylogenetic tree of Lhcbs from Castor bean, Physic nut, Cassava and Rubber tree with homologous proteins from other species such as Creinhardtii, Moss, Arabidopsis and Rice

最后，遵循擬南芥中的命名規(guī)則，將蓖麻、麻瘋樹、木薯和橡膠樹的Lhcb基因和蛋白按著進(jìn)化關(guān)系依次命名如表2和圖1所示。

3 討 論

光合作用是綠色植物最重要的生物學(xué)過程，它們通過利用捕光色素蛋白復(fù)合體接收太陽能來同化CO2。捕光色素蛋白復(fù)合體由色素分子及與之結(jié)合的捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白（LHC）構(gòu)成。雖然植物體內(nèi)的光系統(tǒng)Ι（PSΙ）和PSΙΙ都含有各自的 LHC（即 LHCΙ和 LHCΙΙ)，但 LHCΙΙ以蛋白含量豐富、生理功能復(fù)雜、且易被大量提取而倍受關(guān)注。LHCΙΙ最早發(fā)現(xiàn)于1975年[20]，隨后其部分編碼基因于1981年作為首批基因被克隆[21]，后來隨著一些高等植物基因組序列的釋放，Lhcb基因家族先后在擬南芥、楊樹、水稻等模式植物中得到了系統(tǒng)鑒定[6-8]。在目前已鑒 定 的 Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4、Lhcb5、Lhcb6、Lhcb7和Lhcb8等8個(gè)亞家族中，根據(jù)表達(dá)豐度的高低，Lhcb1、Lhcb2和Lhcb3早期被稱為 主 要 LHCΙΙ，Lhcb4（CP29）、Lhcb5（CP26）和Lhcb6（CP24）被稱為微量LHCΙΙ；Lhcb7后來由Klimmek等[7]鑒定并命名；Lhcb8在擬南芥中最早被命名為AtLhcb4.3，但因其序列及表達(dá)調(diào)控模式與AtLhcb4.1和AtLhcb4.2具有較大差異而被重新命名[7]。1994年，AtLhcb1 3.4 ?的晶體結(jié)構(gòu)被揭示，結(jié)果顯示，Lhcb1-色素蛋白復(fù)合體中有80%的組分為多肽（含有232個(gè)氨基酸殘基，包含3個(gè)跨膜α-螺旋），另外還含有12個(gè)葉綠素（7個(gè)Chla，5個(gè)Chlb）和2個(gè)葉黃素分子[20]。

大戟科是一個(gè)包含300余屬8 000多種植物的大科，其中不乏蓖麻、麻瘋樹、木薯、橡膠樹、油桐、烏桕和一品紅等重要經(jīng)濟(jì)作物，該科植物的一個(gè)顯著特征就是光合效率特別高。鑒于LHCΙΙ在植物光合作用中的重要作用，研究對(duì)蓖麻、麻瘋樹、木薯和橡膠樹等已完成全基因組測序的4個(gè)大戟科植物的Lhcb基因家族進(jìn)行了全面鑒定，結(jié)果顯示：蓖麻、麻瘋樹、木薯和橡膠樹分別含有10、10、13和15個(gè)Lhcb基因，分屬于Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4、Lhcb5、Lhcb6、Lhcb7 和Lhcb8等8個(gè)亞家族；總體而言，蓖麻和麻瘋樹中的基因數(shù)目和組成都與水稻相近，而木薯和橡膠樹中的基因數(shù)目和組成與擬南芥較為相近，雖然多數(shù)亞族主要以單拷貝形式存在，但成員數(shù)最多的也高達(dá)4個(gè)。

通過將蓖麻、麻瘋樹、木薯和橡膠樹的LHCΙΙ與萊茵衣藻、小立碗蘚、水稻、擬南芥等模式生物中的同源蛋白共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，研究發(fā)現(xiàn)Lhcb的8個(gè)亞家族具有不同的起源和進(jìn)化速度。雖然Lhcb4、Lhcb6與Lhcb8亞族聚在一起，具有較近的親緣關(guān)系，Lhcb4亞族早于單細(xì)胞的藻類中就已產(chǎn)生，并在小立碗蘚、擬南芥和楊樹中出現(xiàn)過基因擴(kuò)增；Lhcb6亞族在光合生物向陸地進(jìn)化后產(chǎn)生，在小立碗蘚、楊樹、木薯和橡膠樹中出現(xiàn)過基因擴(kuò)增；Lhcb8亞族在單、雙子葉植物分化后產(chǎn)生，且為雙子葉植物所特有。

Lhcb5和Lhcb7亞族具有較近的親緣關(guān)系，它們在單細(xì)胞的藻類中都已存在。在后來的進(jìn)化中，Lhcb7亞族相對(duì)保守，沒有出現(xiàn)過明顯的基因擴(kuò)增，而Lhcb5亞族則在小立碗蘚、木薯和橡膠樹中均出現(xiàn)過基因擴(kuò)增現(xiàn)象。

Lhcb1、Lhcb2與Lhcb3亞族具有較近的親緣關(guān)系，它們可能由藻類來源的原始祖先向3個(gè)方向進(jìn)化而成，其中，Lhcb1最為原始，并且進(jìn)化速度也最快，目前已在不同物種中進(jìn)化形成了數(shù)個(gè)分支；Lhcb3亞族可能是該大類最早分化出來的一支，進(jìn)化最先發(fā)生于苔蘚類生物，目前業(yè)已形成獨(dú)立的1類，其在楊樹和橡膠樹中出現(xiàn)過基因擴(kuò)增；在高等植物中，Lhcb2亞族可能通過內(nèi)含子的獲得而分化出來，其在楊樹、木薯和橡膠樹中均出現(xiàn)過基因擴(kuò)增。

總之，蓖麻、麻瘋樹、木薯和橡膠樹的鑒定不僅豐富了Lhcb基因家族的成員數(shù)，同時(shí)也為下一步闡明這4種乃至其它大戟科植物高光效的分子機(jī)理奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Genome-wide identif i cation, classif i cation and phylogenetic analysis of Lhcb gene family in Euphorbiaceae plants

ZOU Zhi, AN Feng, YANG Li-fu, WANG Zhen-hui, YUAN Kun
(Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture/Rubber Research Ιnstitute (RRΙ), Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences (CATAS), Danzhou 571737, Hainan, China)

Euphorbiaceae is a large plant family containing more than 8 000 species which are characterized with high photosynthesis and high biomass. The recently available genome sequences of some Euphorbiaceae plants such as castor bean (Ricinus communis), physic nut (Jatropha curcas), cassava (Manihot esculenta) and rubber tree (Hevea brasiliensis) provide an opportunity to analyze specif i c gene families. Ιn this study, a genome-wide search was carried out to identify Lhcb gene family, which encodes several chlorophyllbinding proteins def i ned as LHCΙΙ involved in light harvesting and energy transfer to the reaction center of photosystem ΙΙ (PSΙΙ), in these four Euphorbiaceae plants. As a result, a number of 10, 10, 13 and 15 Lhcb genes representing 8 subgene families named Lhcb1, Lhcb2, Lhcb3, Lhcb4, Lhcb5, Lhcb6, Lhcb7 and Lhcb8 were identif i ed from castor bean, physic nut, cassava and rubber tree, respectively. These genes contain 0～5 introns, and some of them were found to have alternative splicing isoforms. Phylogenetic analysis suggests a early origin of subgene family Lhcb1, Lhcb4, Lhcb5 and Lhcb7 up to unicellular algae, and subfamily Lhcb3 and Lhcb6 appear in land organisms, while subfamily Lhcb2 and Lhcb1 presents only in high plants and dicotyledons, respectively. Ιn all four analyzed Euphorbiaceae plants, gene amplif i cation was found in subfamily Lhcb1, while gene amplif i cation of subfamily Lhcb2 and Lhcb5 were only found in cassava and rubber tree plants. Ιn rubber trees, amplif i cation events also occured in subfamily Lhcb2 and Lhcb5.

Euphorbiaceae plant; genome-wide; Lhcb gene family; identif i cation; classif i cation; phylogenetic analysis

S718.46

A

1673-923X(2013)12-0046-07

2013-04-12

國家自然科學(xué)基金(31100460,31100460)；海南省重點(diǎn)科技項(xiàng)目(90107)；海南省自然科學(xué)基金(312026)和中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(1630022011014)

鄒 智（1982-），男，湖南新化人，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)；E-mail：zouzhi2008@126.com

[本文編校：文鳳鳴]