泡桐ITS序列測(cè)定及特征分析

申響保，喬 杰，李芳東，袁德義

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003）

泡桐ITS序列測(cè)定及特征分析

申響保1，喬 杰2，李芳東2，袁德義1

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003）

通過加入乙酸鈉優(yōu)化DNA提取方法，針對(duì)泡桐ITS的高GC含量模板，在反應(yīng)體系中加入DMSO優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，有效擴(kuò)增了泡桐ITS序列。采用PCR直接測(cè)序和pGM-T載體克隆測(cè)序的方法相互驗(yàn)證序列，提高所得ITS序列的準(zhǔn)確性，為采用泡桐ITS序列對(duì)泡桐的系統(tǒng)發(fā)育及遺傳多樣性等研究提供新的方法。

泡桐；ITS序列；特征分析

泡桐Paulownia俗稱水桐、大果泡桐、桐木樹等，在我國分布廣泛，屬廣布種。它既是優(yōu)良的速生用材樹種也是常見的綠化造林樹種，農(nóng)桐兼作，用途廣泛，因此發(fā)展泡桐產(chǎn)業(yè)具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。泡桐屬歸屬于玄參科，毛泡桐P.tomentosa為該屬的模式種，大型喬木，但該科的其它屬基本上都屬于草本植物，因此也有人把泡桐單列為泡桐科。對(duì)于屬內(nèi)種的分類，常見的說法是7個(gè)種[1]，法國人Dode[2]將7個(gè)種分為二組，Sect.Ⅰ.Imperiales Dode（包括毛泡桐P.tomentosa(Thunb.)Steud，光泡桐P. tomentosa va. tsinlingensis(Pai) Gong Tong，蘭考泡桐P. elongata S.Y.Hu，楸葉泡桐P. catalpifolia Gong Tong，白花泡桐P.fortunei (Seem.)Hemsl.） 和Sect.Ⅱ.Fortuneana Dode（包括臺(tái)灣泡桐P. kawakamii Ito，川泡桐P. fargesii Franch，南方泡桐P. australis Gong Tong）。胡秀英[3]認(rèn)為除上述二組外，應(yīng)另增設(shè)一組Sect. Kawakamia S.Y.Hu。也有人認(rèn)為現(xiàn)存的許多雜交起源或地理種源的其它泡桐如亮葉毛泡桐、山明泡桐、鄂川泡桐、建始泡桐、成都泡桐、宜昌泡桐、興山泡桐等也能單獨(dú)成種。分類學(xué)家各持己見，使得基于形態(tài)學(xué)標(biāo)記的泡桐屬內(nèi)種間關(guān)系仍然模糊。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，不同DNA片段或基因序列分析廣泛應(yīng)用于植物系統(tǒng)分類研究中，其中內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔（Internal Transcribed Spacer，簡(jiǎn)稱ITS）已成為研究被子植物屬內(nèi)種間和較近屬間關(guān)系中應(yīng)用最為廣泛的序列之一。ITS區(qū)是18S-26S核 糖 體 DNA（nuclear ribosomal DNA，nrDNA）轉(zhuǎn)錄單位的一部分，包括5.8S亞基，ITS1和ITS2兩個(gè)間隔區(qū)，以串聯(lián)重復(fù)方式多拷貝存在于染色體中，早期的一些研究發(fā)現(xiàn)其拷貝間已經(jīng)完全協(xié)同進(jìn)化[4-5]，因此擴(kuò)增出泡桐的ITS序列用以厘清泡桐種間關(guān)系具有一定的分類學(xué)意義。Paul M．Beardsley[6]曾測(cè)定過不完整的泡桐ITS序列（Genbank編號(hào)：AF478941），600 bp長(zhǎng)度的ITS序列中有63個(gè)未知堿基，甚至連5.8S都不夠完整，這給不同物種序列比對(duì)帶來困難，仍需準(zhǔn)確測(cè)定泡桐ITS序列。鑒于ITS序列本身較高GC含量的特征，本研究通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，采取直接測(cè)序和克隆測(cè)序相結(jié)合，進(jìn)行生物信息學(xué)分析得到泡桐屬部分物種的ITS序列，以期其能對(duì)泡桐屬其它種ITS序列的測(cè)定有一定的借鑒作用，對(duì)分析泡桐屬種間系統(tǒng)關(guān)系中得到正確可靠的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

泡桐來源于國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心在湖北省咸寧市的泡桐種質(zhì)資源庫和江西省共青城縣的泡桐種質(zhì)資源庫。實(shí)驗(yàn)材料為7月份采摘的成熟葉片，-70℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑和器材

大腸桿菌感受態(tài)DH5α，pGM-T連接試劑盒，PCR產(chǎn)物回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒，Pfu酶，X-gal，IPTG，dNTPs，D2000，D15000 等試劑均來自天根生化有限公司，其它為常規(guī)實(shí)驗(yàn)試劑。儀器設(shè)備主要有ABI Veriti梯度PCR儀，Thermo3410超低溫冰箱，泰斯特CJ-1D超凈工作臺(tái)，Microfuge 22R小型高速離心機(jī)，各種規(guī)格Eppendorf移液器，BIO-RAD Power Pac HV電泳儀，G：BOX-HR凝膠成像系統(tǒng)以及泰斯特202-1AB恒溫培養(yǎng)箱等。

1.3 泡桐DNA的提取與檢測(cè)

泡桐核酸的提取主要參照張延召等[7]的CTABⅡ法，在此基礎(chǔ)上有所改良，即在最后一次用無水乙醇沉淀核酸前加入1/10體積的乙酸鈉溶液（3M，pH5.2）。檢測(cè)時(shí)用含EB（Et，溴化乙錠）的0.8%瓊脂糖做膠，電泳100V，30 min，最后用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照成像。

1.4 PCR擴(kuò)增

本實(shí)驗(yàn)采用ITS的通用引物[8]ITS4和ITS5（序列見表1）。反應(yīng)體系為去離子無菌水17.25 μL，10×Pfu Buffer 3 μL，dNTPs 3 μL，引物各加 1.5 μL，Pfu Polymerase 0.75 μL，模板 DNA 1.5 μL，DMSO（Dimethyl Sulfoxide，二甲基亞砜）1.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94℃5 min，變性94℃30 s，退火60℃35 s，延伸72℃70 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min，降至12℃保存。

1.5 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)、克隆與測(cè)序

反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓為90 V，25 min。持手提式紫外照射儀，設(shè)置波長(zhǎng)365 nm，檢測(cè)切膠回收目的條帶。用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化含PCR產(chǎn)物的凝膠，把產(chǎn)物濃縮至30 μL，采用pGM-T連接試劑盒把PCR產(chǎn)物連接至載體。用42度熱激的方式將連接好的載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，平板涂抹X-gal和IPTG，37度培養(yǎng)12小時(shí)，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑選單克隆菌落，搖菌8小時(shí)后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，以ITS4和ITS5引物對(duì)重組質(zhì)粒做PCR反應(yīng)，進(jìn)行陽性克隆檢測(cè)。測(cè)序是使用ITS4和ITS5做PCR直接測(cè)序，同時(shí)也用T7和SP6引物（序列見表1）對(duì)陽性克隆測(cè)序，測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，使用的是ABI3730xl測(cè)序儀。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用引物Table 1 Primers used in experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 高質(zhì)量DNA提取

高質(zhì)量泡桐DNA的提取主要困難在于泡桐葉片中含有較高的酚類和多糖類物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)酚類物質(zhì)多加入終濃度4%的β-巰基乙醇抑制酚類在細(xì)胞裂解階段的褐化，另外加入1.4M的氯化鈉能有效去除多糖。在DNA提取操作后期，殘留的多酚類物質(zhì)會(huì)氧化形成褐色非可溶性物質(zhì)與DNA結(jié)合，此時(shí)加入乙酸鈉能消除色素雜質(zhì)，這樣的提出的DNA無論純度跟完整性都比較高。如圖：

2.2 PCR優(yōu)化

圖1 改良CTAB法提取泡桐屬植物DNAFig.1 Paulownia DNA extracted by modif i ed CTAB method

ITS序列具有許多發(fā)夾結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定緊湊的二級(jí)結(jié)構(gòu)[9]，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)時(shí)，高GC含量區(qū)域的模板在復(fù)性過程中易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，DNA聚合酶可能會(huì)跳躍這些結(jié)構(gòu)從而得到非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物[10]。因此，為得到理想的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物常在反應(yīng)液中添加解鏈劑DMSO（Dimethyl Sulfoxide，二甲亞砜）等有機(jī)物，它能有效破壞模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)，降低反應(yīng)的變性溫度，但過量的DMSO亦能抑制聚合酶的活性。因此，適量的DMSO能提高擴(kuò)增效率和特異性，防止ITS假基因序列的擴(kuò)增[11]。為優(yōu)化反應(yīng)體系，DMSO用量設(shè)計(jì)了一個(gè)濃度梯度實(shí)驗(yàn)，即從占比反應(yīng)液的2%到5%，每個(gè)梯度取2個(gè)樣進(jìn)行重復(fù)，綜合擴(kuò)增效果，最終選用5%的DMSO用量。如圖：

圖2 DMSO用量比較Fig.2 Amplif i cation effects with different amounts of DMSO

2.3 序列的生物信息學(xué)分析

在生物界，高度保守的5.8S區(qū)和變異較快的ITS1、ITS2區(qū)序列已被公認(rèn)為是有功能的ITS序列[12]。在被子植物中，5.8S亞基在進(jìn)化上是高度保守的一段長(zhǎng)約164 bp～165 bp的序列，由于ITS拷貝眾多，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，即使個(gè)體內(nèi)的nrDNA也呈現(xiàn)出一定的多態(tài)性，也有部分退化為非功能序列。ITS非功能序列中的5.8S常有不同程度的長(zhǎng)度差異，在進(jìn)化速率上與功能序列不完全一致，在系統(tǒng)發(fā)育研究中，不進(jìn)行真假基因判斷可能導(dǎo)致序列取樣不準(zhǔn)，從而錯(cuò)誤評(píng)估所研究的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，因此利用ITS序列分析時(shí)有必要進(jìn)行序列的功能性分析。

5.8S的完整性和ITS序列中GC含量以及ITS序列的相似性常用于判斷真假ITS基因序列的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)選取幾種玄參科植物的ITS序列和毛泡桐相比較，采用生物學(xué)軟件Vector NT1對(duì)序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所得到的泡桐ITS與其它玄參科物種相似性大多在90%以上（見表2）。采用生物學(xué)軟件Clustal X對(duì)序列進(jìn)行Alignment比較時(shí)發(fā)現(xiàn)泡桐與其它玄參科物種的5.8S均為165bp，且序列完全一致，也進(jìn)一步驗(yàn)證了泡桐ITS序列測(cè)定的準(zhǔn)確性。泡桐ITS長(zhǎng)度及GC含量與其它物種大致相近，在GC含量上泡桐要比其它物種高，這也是克隆的困難之處。

表 2 泡桐與玄參科不同屬物種序列的相似性Table 2 Simlarity of nucleotide sequences of ITS from Paulownia tomentosa and other some plants in Scrophularia

3 討論與結(jié)論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，植物DNA的提取方法已經(jīng)比較成熟，但是由于不同植物的生物學(xué)特征，在DNA提取中對(duì)通用的提取方法有進(jìn)一步優(yōu)化的必要。比如，在泡桐DNA提取過程中加入乙酸鈉能有效去除核酸中所含的色素雜質(zhì)，得比較高質(zhì)量的泡桐基因組。

被子植物的ITS序列GC含量較高，一般超過55%，而泡桐達(dá)到了66%，按常規(guī)PCR技術(shù)克隆ITS序列較為困難，且ITS還可能存在多態(tài)性，因此樣品也可能存在非特異性擴(kuò)增，因此在PCR反應(yīng)體系中加入適量的抑制劑破壞模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)，降低變性溫度，在克隆泡桐ITS序列時(shí)十分有效。雖然能夠成功擴(kuò)增目的產(chǎn)物，但是用PCR直接測(cè)序很容易出現(xiàn)套峰，或測(cè)序結(jié)果無信號(hào)，測(cè)序的結(jié)果很難把握準(zhǔn)確，往往需要重復(fù)測(cè)序，本實(shí)驗(yàn)另外通過T載體克隆測(cè)序?qū)π蛄羞M(jìn)行相互驗(yàn)證，以求達(dá)到準(zhǔn)確。

隨著近幾年國家對(duì)林業(yè)行業(yè)的重視，對(duì)泡桐研究投入的增加，在泡桐種源以及遺傳多樣性研究上取得了一定的進(jìn)展[13-14]，但是選用的分子標(biāo)記的準(zhǔn)確性隨實(shí)驗(yàn)人員操作而有一定的誤差，如果能以諸如ITS序列等基因組序列來分析系統(tǒng)發(fā)育或遺傳多樣性將極大提高準(zhǔn)確性。無論是從泡桐ITS的完整性還是ITS長(zhǎng)度及GC含量上分析，本實(shí)驗(yàn)方法所得到的泡桐ITS序列是比較準(zhǔn)確的。因此，本研究測(cè)定出來的ITS序列對(duì)于泡桐的研究有一定的意義。

[1] 鐘補(bǔ)求.中國植物志[M].北京:科學(xué)出版社,2010.

[2] Dode L A.Notes dendrologiques.VIII.Sur un peuplier européen du sous-genre Turanga,Populus illicitana[J].Bull.Soc.Dendr.,France,1908,8:160-162.

[3] 胡秀英.中華冬青[J].清華大學(xué)學(xué)報(bào),1959特刊,1(1):44.

[4] Scott O R, Arnold J B. Ribosomal RNA genes in plants:variability in copy number and in the intergenic spacer [J]. Plant Molecular Biology, 1987, 9(5): 509-520.

[5] Hamby R K, Zimmer E A. Ribosomal RNA as a phylogenetic tool in plant systematic[J].Molecular Systematics of Plants, 1992,6: 50-91.

[6] Paul M.Beardsley,Richard G.Olmstead.Redef i ning Phrymaceae:the placement of Mimulus, tribe Mimuleae, and Phryma[J]. Am.J. Bot., 2002,89(7):1093-1102.

[7] 張延召,曹喜兵,翟曉巧,等.適用于AFLP分析的泡桐DNA提取方法研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009, 43(6):610-614.

[8] White T J, Bruns T, Lee S, et al. PCR protocols:a guide to methods and applications[M].San Diego:Academic Press,1990.

[9] Venkate swarlu K, Nazar R. A conserved core structure in the 18-25S rRNA intergenic region from tobacco,Nicotiana rustica[J].Plant. Mol. Biol., 1991,17:189-194.

[10] Viswanathan V K, Kremarik K, Cianciotto N P. Template secondary structure promotes polymerase jumping during PCR amplif i cation[J]. Bio.Techniques,1999,27:508-511.

[11] 鄭小艷,蔡丹英,藤元文.DMSO對(duì)梨屬植物ITS區(qū)擴(kuò)增及測(cè)序的影響[A].見:束懷瑞主編.園藝學(xué)進(jìn)展（第七輯）[C].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2006,141-145.

[12] Bailey C D, Timothy G C, Stephen A H, et al. Characterization of angiosperm nrDNA polymorphism, paralogy, and pseudogenes[J].Molecular Phylogenetics and Evolution, 2003,29(3):435-455.

[13] 鄧建軍,李芳東,喬 杰,等.白花泡桐優(yōu)樹種質(zhì)資源收集保存及繁殖技術(shù)研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2011,31(4):50-55.

[14] 李芳東,袁德義,莫文娟,等.白花泡桐種源遺傳多樣性的ISSR分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2011,31(7):1-7.

Mensuration of ITS sequences and characteristics analysis of Paulownia

SHEN Xiang-bao1, QIAO Jie2, LI Fang-dong2, YUAN De-yi1
(1. Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. Paulownia Research and Development Center of State Forestry Administration, Zhengzhou 450003, Henan, China)

Through optimizing DNA extraction method by adding sodium acetate, taking into account the template with high GC content in the ITS of Paulownia, the DMSO and optimization of PCR reaction system were joined in the reaction system, thereby amplif i ying the ITS sequence of Paulownia. The mutual verif i cation between PCR direct sequencing and pGM-T vector clone sequencing raised the accuracy of the obtained ITS sequences. The results provide a new method for using ITS Paulownia sequences to research phylogeny and genetic diversity of Paulownia provide.

Paulownia; ITS sequence; characteristic analysis

S792.43

A

1673-923X(2013)10-0030-04

2013-03-16

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)“泡桐基因庫與育種群體建立技術(shù)研究”(200804021)

申響保（1978-），男，湖南邵東人，博士研究生，講師，主要從事林木遺傳育種研究；E-mail：shenxb_2008@qq.com

[本文編校：吳 彬]