伯樂樹cpDNA-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化與引物篩選

胡尚力，徐剛標，梁 艷，劉雄盛，肖玉菲，郝博搏

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004）

伯樂樹cpDNA-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化與引物篩選

胡尚力，徐剛標，梁 艷，劉雄盛，肖玉菲，郝博搏

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004）

伯樂樹為國家一級保護植物，在研究被子植物的系統(tǒng)發(fā)育和古地理、古氣候等方面具有重要的科學(xué)價值。cpDNA-PCR反應(yīng)是在分子水平上確定伯樂樹系統(tǒng)分類的基礎(chǔ)。建立了伯樂樹cpDNA-PCR反應(yīng)體系，對影響擴增反應(yīng)的因素（Mg2+濃度、dNTP濃度、引物濃度以及模板DNA濃度）進行了優(yōu)化，得到了伯樂樹cpDNAPCR擴增反應(yīng)的最佳體系，并篩選出了適合伯樂樹分子譜系地理研究的非編碼區(qū)序列和引物。伯樂樹cpDNAPCR最佳反應(yīng)體系為：30 μL反應(yīng)體系含有10×PCR buffer、2.9 mmol Mg2+、120 mmol dNTP、上下游引物各11 μmol、DNA模版30 ng以及3個單位的Taq酶。適合于伯樂樹分子譜系地理學(xué)研究的3對引物及其退火溫度為PipetB1411F-PipetD738R(52℃ )、psbA-trnHGUG(59℃ )、trnL-trnF(56℃ )。

伯樂樹；cpDNA；PCR體系優(yōu)化；引物篩選

伯樂樹Bretschneidera sinensis Hemsl.為伯樂樹科伯樂樹屬，因其花萼似鐘狀，故又名鐘萼樹，零散分布于浙江、臺灣、福建、湖南、湖北、廣東、廣西和四川等?。▍^(qū)），是我國特有的單型科植物，已被列為國家一級保護植物[1]，在研究被子植物的系統(tǒng)發(fā)育和古地理、古氣候等方面具有重要的科學(xué)價值。

目前對于伯樂樹遺傳多樣性[2-3]、生物學(xué)特征、生態(tài)學(xué)特性、系統(tǒng)發(fā)育、種群遺傳及繁殖技術(shù)等方面已進行了大量的研究工作[4]，但伯樂樹系統(tǒng)地位仍存在爭議[5]。葉綠研究（chloroplastc DNA，cpDNA）分子標記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物系統(tǒng)分類、系統(tǒng)發(fā)育以及種群遺傳結(jié)構(gòu)等方面[6-8]。cpDNA分子標記的基礎(chǔ)是PCR反應(yīng)，受多種影響因素。PCR技術(shù)目前在診斷遺傳病、克隆基因、植物育種等方面均有應(yīng)用[9-13]。本研究通過優(yōu)化伯樂樹cpDNA-PCR反應(yīng)體系，篩選出適合于系統(tǒng)分類研究的非編碼區(qū)序列引物，為在分子水平上確定伯樂樹系統(tǒng)分類地位奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

優(yōu)化cpDNA-PCR體系的12株伯樂樹標本于2012年7～10月采自廣西貓兒山自然保護區(qū)。取其新鮮葉片用硅膠干燥后，帶回實驗室儲存于-70℃冰箱中備用。

cpDNA非編碼序列標記引物由南京金斯瑞生物科技有限公司提供（見表1），Taq DNA Ploymerase、dNTPs、Mg2+、10×Buffer、Marker DGL1500、Maker DGL2000購置于天根生化科技有限公司。

表1 實驗所用引物序列Table 1 Primer sequences used in analysis

1.2 基因組DNA提取與檢測

采用改良的CTAB法提取伯樂樹總DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠對基因組DNA質(zhì)量進行電泳檢測，DNA濃度和純度采用Eppendorf公司的Biophotometer核酸蛋白分析儀進行測定，并將DNA濃度稀釋為20 ng/μL。

1.3 PCR反應(yīng)及產(chǎn)物檢測

[14]，首先確定基本擴增反應(yīng)體系 (30 μL) 為：3 μL 10×PCR buffer、2.5 mmol Mg2+、100 mmol dNTP、上下游引物各 10 μmol、DNA模版25 ng以及3個單位的Taq酶。

PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性 4 min，35個循環(huán)；95℃50 s，退火50 s，72℃5 min；最后以72℃延伸10 min。設(shè)計反應(yīng)條件中的4種不同因素（Mg2+濃度、dNTP濃度、引物濃度以及模板DNA濃度）進行梯度實驗。濃度梯度見表2。

表2 cpDNA-PCR反應(yīng)系統(tǒng)濃度設(shè)計Table 2 Concentration grads for cpDNA-PCR reaction system

擴增產(chǎn)物的檢測：取2 μL 上樣緩沖液與5 μL擴增產(chǎn)物混合后在濃度為1.6%的瓊脂糖上進行電泳，電泳緩沖液為1×TAE，電壓5 V/cm。在SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)上記錄結(jié)果。

1.4 引物篩選

對 rpl16、trnK、rps16、petD內(nèi) 含 子，trnS-trnG、trnT-trnF、atpB-rbcL、psbA-psbH 、trnL-trnF、trnC–rpoB基因間隔區(qū)共9對引物進行篩選，得到適合cpDNA基因間隔區(qū)標記的引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 伯樂樹葉綠體基因組DNA的純度與濃度

12株伯樂樹標本提取的總DNA經(jīng)核酸蛋白分析儀測定的純度與濃度結(jié)果見表3。

表3 伯樂樹葉綠體基因組DNA的純度與濃度Table 3 The concentration and purity of total DNA

OD260nm/OD280nm比值是衡量總DNA純度的指標。若比值低于1.6，說明DNA中混有RNA雜質(zhì)，若比值高于2.0則說明DNA中混有蛋白質(zhì)雜質(zhì)。由表3可知，比值在1.6～2.0之間，說明實驗提取的總DNA含量較高，符合PCR反應(yīng)所需的要求。

2.2 cpDNA非編碼序列的PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序

2.2.1 Mg2+濃度的確定

Mg2+是反應(yīng)混合物中Taq酶的激活物，并且影響反應(yīng)的效率[15]。4個Mg2+濃度梯度下擴增產(chǎn)物凝膠成像結(jié)果如圖1所示。圖1中Marker為D2000。

圖1 不同Mg2+濃度下擴增產(chǎn)物凝膠電泳Fig.1 The gel electrophoresis image of different Mg2+concentrations

由圖1可以看出，隨著Mg2+濃度的升高，電泳條帶由暗變亮，2.9 mmol時條帶明亮且清晰。

2.2.2 dNTP濃度的確定

dNTP在生物DNA、RNA合成中以及PCR反應(yīng)中起原料作用。在PCR反應(yīng)中，dNTP的濃度會影響非靶位置啟動和延伸時的核苷酸錯誤摻入[16]。本實驗設(shè)置了4個梯度的dNTP濃度，擴增結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同dNTP濃度下擴增產(chǎn)物凝膠電泳Fig. 2 The gel electrophoresis image of different dNTP concentrations

由圖2可見，dNTP濃度在80～140 mmol時電泳條帶均很明亮，而濃度為120 mmol時條帶最為清晰。

2.2.3 引物濃度的確定

引物的作用是幫助游離的堿基結(jié)合到DNA單鏈上去，在一定范圍內(nèi)，引物濃度越大DNA復(fù)制越快，超過一定濃度，即達到飽和狀態(tài)，對PCR影響減弱。如果引物濃度過高，還會因為引物與體系中的鎂離子結(jié)合而影響酶的活性，并產(chǎn)生大量引物二聚體[17]。本實驗設(shè)置了4個梯度的引物濃度，擴增結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同引物濃度下擴增產(chǎn)物凝膠電泳Fig. 3 The gel electrophoresis image of different primers concentrations

從圖3可以看出，當上下游引物濃度為10 mmol和12 mmol時，條帶清晰但較暗；當濃度為9 mmol和11 mmol時條帶清晰，但11 mmol濃度條帶更為明亮。因此上下游引物最佳濃度為11 mmol。

2.2.4 DNA模版濃度的確定

DNA模版就是要擴增的DNA片段，同樣在一定范圍內(nèi)，模版濃度越高DNA復(fù)制越快，但如果模版濃度過高會導(dǎo)致非特異性的擴增，并且在電泳檢測時會導(dǎo)致條帶彌散[18]。4種不同濃度的DNA模版擴增結(jié)果如圖4所示。

從圖4可知，當DNA模板為20 ng/μL時，條帶較為暗；濃度達到25 ng/μL時，條帶明顯變亮。從擴增結(jié)果來看，DNA模板濃度在30 ng/μL時最好，條帶最為清晰、明亮。

2.3 伯樂樹cpDNA-PCR的最優(yōu)反應(yīng)體系

根據(jù)PCR各項反應(yīng)因素優(yōu)化結(jié)果，得到的伯樂樹cpDNA-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系（30 μL）為：10×PCR buffer、2.9 mmol Mg2+、120 mmol dNTP、上下游引物各11 μmol、DNA模版30 ng以及3個單位的Taq酶。

圖4 不同DNA模版濃度下擴增產(chǎn)物凝膠Fig.4 The gel electrophoresis image of different template DNA concentrations

2.4 引物篩選

根據(jù)已優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系和程序，對rpl16、trnK、petD 內(nèi) 含 子，trnS-trnG、trnT-trnF、atpB-rbcL、psbA-psbH 、trnL-trnF、trnC–rpoB基因間隔區(qū)共9對引物進行篩選。實驗中引物的退火溫度與時間取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有模版DNA的序列長度[19]。而引物的退火溫度會對引物與模版的特異性結(jié)合產(chǎn)生影響，因此對于不同引物的退火溫度需要進行單獨且細致的篩選。本試驗中先以Tm值計算得出的理論退火溫度為標準，進行梯度為2℃的6個退火溫度的試驗，得到初步的最適溫度。再以這個溫度為標準，設(shè)置梯度為0.5℃的6個退火溫度，最終確定該引物的最佳退火溫度。最終獲得電泳條帶清晰、明亮、單一的引物共3對，結(jié)果見表4。

表4 篩選出的4對引物Table 4 The four pairs of selected primers

利用3對最佳引物獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.6%凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖5、圖6、圖7。

圖5 petD內(nèi)含子擴增產(chǎn)物凝膠電泳Fig.5 The gel electrophoresis image of petD intron amplif i cation result

圖6 psbA-trnH基因間隔區(qū)擴增產(chǎn)物凝膠電泳Fig.6 The gel electrophoresis image of psbA-trnH intergenice spacer amplif i cation result

圖7 trnL-trnF內(nèi)含子擴增產(chǎn)物凝膠電泳Fig.7 The gel electrophoresis image of trnL-trnF intron amplif i cation result

3 結(jié) 論

cpDNA分子標記是基于PCR反應(yīng)的技術(shù)，受到反應(yīng)中多種因素的影響，所以應(yīng)對各種因素進行優(yōu)化以得到最佳的反應(yīng)體系。對于實驗結(jié)果的分析，是以凝膠電泳條帶清晰程度、亮度以及單一性來判斷的，具有一定主觀性。因此應(yīng)進行多次重復(fù)試驗，去除主觀因素的影響，得到穩(wěn)定的結(jié)果。

實驗得到伯樂樹的最優(yōu)cpDNA-PCR反應(yīng)體系（30 μL） 為：10×PCR buffer、2.9 mmol Mg2+、120 mmol dNTP、上下游引物各11 μmol、DNA模版30 ng以及3個單位的Taq酶。通過優(yōu)化后的體系篩選出適合于伯樂樹分子譜系地理學(xué)研究的3對引物及其退火溫度為：PipetB1411F-PipetD738R（52℃）、psbA-trnHGUG（59 ℃）、trnL-trnF（56 ℃）。

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Optimization of cpDNA-PCR system for Bretschneidera sinensi and primers screening

HU Shang-li, XU Gang-biao, LIANG Yan, LIU Xiong-sheng, XIAO Yu-fei, HAO Bo-bo
(School of Life Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

Bretschneidera sinensis is a kind of national first-grade protected plants and has important scientific value in studying angiosperm’s phylogeny, paleogeography and paleoclimate. The cpDNA-PCR reaction is the basis of determinting the phylogenetic classif i cation of B. sinensis at the molecular level. The concentrations of Mg2+, dNTPs, primers and template DNA affecting the cpDNAPCR that will affect the amplif i ed reaction were optimized to establish the cpDNA-PCR for B.sinensis, and the suitable non-coding sequences and primers for B. sinensis on molecular phylogeography were screened. The optimum 30 μL reaction system contained 10×PCR buffer, 2.9 mmol Mg2+, 120 mmol dNTPs, 11 μmol primers, 30 ng template DNA and 3 units Taq polymerase. The 3 pairs of primers that are appropriate for the geographical study of molecular genealogy of B. sinensis and their corresponding annealing temperatures were screened out as followings: PipetB1411F-PipetD738R (52℃ ), psbA-trnHGUG (59℃ ), trnL-trnF (56℃ ).

Bretschneidera sinensis Hemsl.; cpDNA; optimization of PCR system; primers screening

S794.9；Q78

A

1673-923X(2013)07-0067-05

2012-12-16

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目(201104033)；湖南省研究生科研創(chuàng)新項目(CX2012B326)

胡尚力（1989-），男，湖南湘潭人，碩士研究生，主要從事生物化學(xué)與分子遺傳學(xué)研究

徐剛標（1965-），男，安徽樅陽人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事植物種群遺傳與育種研究

[本文編校：謝榮秀]