IDX法測定油松種子生活力的研究

馬秋月，許靜潔，王添添，李淑嫻

(南京林業(yè)大學 森林資源與環(huán)境學院，江蘇 南京 210037)

IDX法測定油松種子生活力的研究

馬秋月，許靜潔，王添添，李淑嫻

(南京林業(yè)大學 森林資源與環(huán)境學院，江蘇 南京 210037)

采用IDX法測定了不同油松種子的生活力，并比較了各樣品生活力與發(fā)芽率的差異。結果表明：油松種子在清水中浸種24 h、培養(yǎng)30 h(25 ℃)，再用硅膠干燥7 h(30 ℃)時，由于有生活力種子和死亡種子干燥時的失水速度不同，干燥后二者的含水量不同，其在X射線圖像上的差異明顯，可以根據(jù)圖像差異來判斷種子生活力的有無。本次采用IDX法測定的生活力與相應樣品的發(fā)芽率之間差異不顯著，并且各供試種子經(jīng)人工老化處理后發(fā)芽率有一定的下降，此時IDX所測得的生活力也有相應程度的下降。因此IDX法不僅能較好地反映種子的生活力，而且能準確檢測出種子質量的變化過程。

IDX法；油松種子；生活力；發(fā)芽率

傳統(tǒng)的生活力的測定方法，如四唑染色法（TTC）、離體胚法、靛藍染色法等都是有損檢驗[1]，測定完成后的種子不能再繼續(xù)進行發(fā)芽試驗，無法進一步比較生活力測定結果的準確性。水襯比(IDX)法克服了這一缺點，其原理是先用水作襯比劑浸泡、培養(yǎng)種子(I)，使所有的種子都能充分吸收水分，再對其進行干燥(D)。由于死亡種子和有生活力種子細胞膜的透性不同，干燥過程中生活種子內(nèi)含物中膠體的親水性和細胞的保水能力較高，而死亡種子的蛋白質已發(fā)生變性，原生質的透性提高，使種子喪失保水能力，干燥一段時間后生活種子和死亡種子的含水量會存在差異，此時再對其進行X射線攝影(X)，從圖像上可以看到：生活種子由于含有較多的水分，強烈吸收X射線，圖像亮度均勻，胚、胚乳之間的界限無法區(qū)分；而死亡種子或生活力較弱的種子，由于不能保持足夠的水分，圖像上呈現(xiàn)高的光學密度，透光量大，胚、胚乳的各個細部清晰可見[2-3]，根據(jù)X射線圖像的這種差異可以判斷種子生活力的有無?，F(xiàn)在IDX法已被應用到很多植物種子的生活力測定中。早在1990年，Simak就用此方法成功地測定了美國海岸松種子的生活力[4]，后來又有研究者采用此方法測定了華山松[5]、馬尾松、樟子松[6]、火炬松[7]以及小桐子[8]種子的生活力。

油松Pinus tabulaeformis是我國北方主要的造林樹種，每年造林、育苗用種量都很大[9]。我國已有用四唑染色法[10]、離體胚法[11]測定油松種子生活力的標準，但目前還沒有采用IDX法測定該種子生活力的相關研究。由于種粒大小、種皮厚度以及種子體內(nèi)營養(yǎng)物質的不同，在采用IDX法測定時所使用的浸種、培養(yǎng)、干燥時間均會有一定的差異。本研究擬以油松種子為材料，研究IDX法測定該種子生活力的條件，并將生活力測定后的種子進行定位發(fā)芽試驗，進一步判斷生活力與發(fā)芽率之間的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究材料是2011年秋天在陜西采集的種子，其中咸陽(1份)，延安(2份)，種子采后貯藏于冰箱中。

1.2 最佳培養(yǎng)時間的篩選

隨機抽取一定數(shù)量的油松種子分別作如下處理：不浸種，不培養(yǎng)（CK）；清水浸種24 h+培養(yǎng)24 h；清水浸種24 h+培養(yǎng)30 h；清水浸種24 h+培養(yǎng)36 h；清水浸種24 h+培養(yǎng)40 h；清水浸種24 h+培養(yǎng)48 h，各處理中浸種、培養(yǎng)均是在25℃下進行。處理結束后用吸水紙吸干種子表面的水分，使用HY-35型農(nóng)用軟X射線機攝影，具體為：電壓25 kV，電流3 mA，時間40 s，焦片距30 cm。拍照時種子擺放在相紙上直接攝影，因此物片距可以忽略不計。照片經(jīng)顯影、定影后比較各處理種子的射線圖像，找到油松種子理想的預處理條件。以上各處理均是每重復取100粒種子，重復4次。

1.3 干燥時間以及種子生活力有無判別標準的確定

選取生活力相對較高的種子(延安2號)和無生活力的種子(延安2號在沸水中煮5 min，自然晾干)各100粒，重復3次，用千分之一天平稱重(M)，按照1.2篩選的浸種、培養(yǎng)條件處理種子，用吸水紙吸干種子表面的水分，稱重(M0)后對種子進行干燥。干燥時將種子置于干燥器中，再將整個干燥器置于30 ℃的電熱鼓風干燥箱中。每隔1小時稱重1次(Mi)，直至死亡種子失去培養(yǎng)過程吸收的所有水分。按照下式計算種子的含水量，分別繪制無生活力種子、有生活力種子的失水曲線。當死亡種子烘干后的含水量約為0時，在1.2的條件下進行X射線攝影，根據(jù)圖像的差異確定油松種子生活力有無的判別標準。

式中i=0，1，2……。

1.4 IDX法測定種子的生活力

隨機抽取6份供試種子(3份為本次所采集的種子，另外3份為各供試材料采用70 ℃熱水處理1 min后的種子)各100粒，重復4次，按照1.2和1.3篩選的條件浸種、培養(yǎng)、干燥、X射線攝影，根據(jù)圖像判斷各供試種子的生活力。

1.5 IDX法生活力與發(fā)芽率結果的比較

將X射線片上的各供試種子按順序擺放在鋪有脫脂棉的發(fā)芽盒中，在25℃下進行定位發(fā)芽率測定，按照《林木種子檢驗規(guī)程》的規(guī)定記錄各供試種子的發(fā)芽粒數(shù)[10]，進一步比較生活力結果與發(fā)芽率間的差異。

2 結果與分析

2.1 浸種、培養(yǎng)時間的確定

對不同浸種、培養(yǎng)時間下的X射線照片比較后發(fā)現(xiàn)，未作培養(yǎng)處理的種子內(nèi)部胚、胚乳的結構清晰可見(圖1.A)；浸種24 h、培養(yǎng)24 h后，胚和胚乳的結構仍隱約可見(圖1.B)；培養(yǎng)時間延長至30 h時，大多數(shù)種子胚、胚乳的界限已分不清(圖1.C)；如果再繼續(xù)延長培養(yǎng)時間至48 h，有的種子已開始萌發(fā)。因此在25 ℃下油松種子適宜的預處理條件為：清水浸種24 h后培養(yǎng)30 h。

圖1 不同條件處理后種子的X射線圖像Fig. 1 Seed images measured by X-ray after different culture treatments

2.2 干燥時間的確定

圖2的結果表明，油松種子經(jīng)過7 h干燥后，無生活力的種子已全部失去培養(yǎng)過程中所吸收的水分，而此時有生活力種子的含水量仍比較高，因此油松種子的最佳干燥時間為7 h。由于死亡種子烘干8 h時的重量低于起始鮮重，因此所測得的含水量為負值。

圖2 干燥過程有生活力種子、無生活力種子含水量變化Fig. 2 Changes of moisture contents of viable and non-viable seeds

2.3 種子生活力有無的判斷標準

有生活力種子的胚腔結構模糊不清，胚隱約可見，胚乳灰暗亮度均勻(圖3.A)；而死亡種子的胚腔結構清晰，胚明顯[5](圖3.B)，據(jù)X射線片圖像上的這種差異可以判斷油松種子生活力的有無。在采用IDX法進行生活力測定時還要注意以下兩個方面：一是無胚粒種子不能萌發(fā)，直接射線攝影可以很好地將其區(qū)別出來，但浸種、培養(yǎng)后無胚粒、有生活力種子的圖像均是胚的結構不清晰。為避免將無胚種子誤判為有生活力的種子，在采用IDX法測定生活力時需結合直接射線攝影，先將無胚種子剔除，并做好記錄。二是發(fā)育不飽滿的種粒，包括兩種類型，分別是胚的長度沒有充滿整個胚腔(本次研究未發(fā)現(xiàn)此情況)，或是胚乳發(fā)育不飽滿，此類情況較多。本次IDX測定后種子的定位發(fā)芽試驗表明，如果發(fā)育的胚乳組織能占滿整個種殼的3/4以上，并且IDX圖像判別也屬于有生活力的種子時，該種子還是能夠萌發(fā)的，因此本次生活力判別時允許有生活力種子胚乳的缺失不超過整個種殼1/4。

2.4 IDX法測得的生活力與發(fā)芽率結果的比較

圖3 有生活力種子、死亡種子干燥7小時后的X射線圖像Fig. 3 Images of viable and non-viable seeds by X ray after drying for 7 hours

從表1可以看出，生活力測定結果略高于發(fā)芽率，但二者之間的差異不顯著(P＜0.05)，這符合生活力測定的原理，即生活力是對種子發(fā)芽潛力的估計，生活力測定時某一粒種子表現(xiàn)為有發(fā)芽潛力也就是有生活力，但發(fā)芽率測定時可能并不表現(xiàn)發(fā)芽。人工老化處理后3份供試種子的發(fā)芽率有一定的下降，所測得的生活力也有相應的降低。因此IDX法不僅能較好的測定種子的生活力，而且能及時測出種子質量的變化過程即其靈敏性也比較高。

表1 IDX法測定的生活力與發(fā)芽率的比較 ?Table 1 Comparison between viability by IDX and real germination rate

2.5 生活力測定與發(fā)芽率測定持續(xù)時間的比較

本研究中，采用IDX法測定油松種子的生活力需要3 d，而按照《林木種子檢驗規(guī)程》的規(guī)定發(fā)芽率測定約需要28 d[10]，如果有的種源的種子有淺休眠現(xiàn)象，發(fā)芽率測定持續(xù)的時間還要長一些。很明顯，IDX法測定所需要的時間比發(fā)芽率短。

3 結論與討論

(1)X射線攝影技術具有快速、準確的特點，由于攝影過程中所使用的X射線劑量較小，對種子的損害也比較小[12]，現(xiàn)在該技術已被廣泛應用到種子的健康測定中[10,13]。有生活力的種子和死亡種子在干燥過程中的失水速度不同，干燥后二者的含水量不同，此時再對其進行X射線攝影，可以通過種子在射線圖片上的差異來判斷其生活力情況。本次6份種子的生活力略高于發(fā)芽率，但二者間差異不顯著，因此IDX法可以較好地測定種子的生活力。由于IDX測定時間不超過3 d，因此該方法還能夠滿足快速的要求,是另一種可靠的測定油松種子生活力的方法。

(2)采用IDX法測定油松種子生活力的條件是：在25 ℃下用清水浸種24 h，培養(yǎng)30 h，再在30 ℃下干燥7 h。X射線攝影時的參數(shù)為：電壓20 kV，電流時間120 mAS。如果浸種、培養(yǎng)溫度超過25 ℃，所使用的時間會略短些，如果低于25 ℃，需要的時間會略長些。

(3)根據(jù)X射線圖像的差異正確判斷種子生活力是IDX法測定準確性的關鍵。有生活力種子的胚、胚乳間界線模糊不清，胚腔結構不明顯,胚隱約可見，胚乳亮度均勻；無生活力種子的胚、胚乳間界線清晰，胚腔結構清楚[4-5]。在采用IDX法時還要注意無胚粒和發(fā)育不飽滿的種子兩種情況。無胚粒的判別最好采用直接射線攝影法先將此類種子剔除。Heidi等的研究表明，發(fā)育不飽滿的種粒，無論是胚的長度沒有充滿整個胚腔的種粒，還是胚乳發(fā)育不飽滿的種粒，都有一定的發(fā)芽能力[14]。本次IDX測定后種子的定位發(fā)芽試驗也表明，如果發(fā)育的胚乳組織占整個種殼的3/4以上，并且IDX圖像判別也屬于有生活力的種子時，該種子還是能夠萌發(fā)的，因此本次判別時也允許有生活力種子胚乳的缺失不超過整個種殼的1/4。再者現(xiàn)行的國際、國家標準在采用四唑染色法測定生活力時也允許胚乳少部分不染色[10-17]。由于本次研究過程中未發(fā)現(xiàn)胚沒有充滿整個胚腔的類型，對此類種子生活力有無的判別還需進一步研究。

(4)X射線攝影技術在種子方面的應用主要有兩大類，一是直接射線攝影法，二是襯比射線攝影法。襯比射線攝影法根據(jù)襯比劑的類型又可以分為水襯比法和重金屬鹽類襯比法。與后者相比，IDX法具有以下優(yōu)點：一是材料經(jīng)濟、方法簡單，不存在襯比劑溶液種類、濃度選擇的問題；二是IDX測定結束后不會影響種子的發(fā)芽，可繼續(xù)進行定位發(fā)芽實驗以判別生活力測定結果的準確性。本研究再次證明IDX法是值得推廣的生活力測定方法，但現(xiàn)在其林木種子的應用還是比較有限的。今后有必要繼續(xù)以其它種子為材料開展相關研究，進一步擴大該方法在生活力測定中的應用。

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A method to determine seeds viability of Pinus tabulaeformis by IDX

MA Qiu-yue, XU Jing-jie, WANG Tian-tian, LI Shu-xian
(College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangshu, China)

The seeds viabilities of different Pinus tabulaeformis were determined by IDX. Before radio photographed the seeds were treated like that： soaking in water for 24 hours and cultured for 30 hours at 25 ℃ followed by drying for 7 hours with silica gel at 30 ℃ . Due to the water loss rate of the viable and dead seeds were different during drying process, their moisture contents were different, two seeds’ differences were signif i cant on the x-ray image, it can be used to judge seeds viability. There were no signif i cant differences between seeds viabilities measured by IDX and the real germination percentages in all the samples. Furthermore, when the germination percentages of the samples declined after artif i cial aging, the viabilities measured by IDX also had the corresponding degree of decline. Therefore, the method of IDX can be used to determine the viability of P. tabulaeformis seeds, and can also accurately detect the quality changes.

IDX; Pinus tabulaeformis seeds; seed viability; seed germination percentage

S791.254

A

1673-923X(2013)03-0075-04

2012-10-16

國家自然科學基金項目（31125008, 31270711）

馬秋月（1987-），女，吉林長春人，碩士研究生，主要研究方向：林木種苗；E-mail： yue.870808@163.com

李淑嫻（1968-），女，山東煙臺人，副教授，主要研究方向：林木種苗科學與技術；E-mail：shuxianli@njfu.com.cn

[本文編校：吳 毅]