去劣疏伐對長白落葉松初級無性系種子園SSR遺傳多樣性的影響

姚 宇，張含國，張 振，張 磊

（東北林業(yè)大學 林木遺傳育種國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

去劣疏伐對長白落葉松初級無性系種子園SSR遺傳多樣性的影響

姚 宇，張含國，張 振，張 磊

（東北林業(yè)大學 林木遺傳育種國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

為了解去劣疏伐對長白落葉松初級無性系種子園遺傳多樣性的影響程度，利用14對SSR引物，對葦河青山長白落葉松初級無性系種子園內38個無性系，共260個親本進行遺傳多樣性的研究。根據子代表現(xiàn)及親本生長結實的能力，設計10%～60%的疏伐強度進行模擬疏伐，利用POPGENE3.2程序分析疏伐前后各個遺傳多樣性參數的變化。結果表明：種子園遺傳多樣性降低程度與疏伐強度呈正相關，40%以內的疏伐強度對種子園遺傳多樣性影響較小，減小幅度小于0.5%，能夠維持種子園較廣泛的遺傳基礎；疏伐后無性系內至少要保留7～9個單株才能維持無性系內的遺傳多樣性，如按照疏伐后保存率為60%推算，長白落葉松種子園建園時，每個無性系至少種植12～15株。

長白落葉松；種子園；SSR標記；遺傳多樣性；去劣疏伐

初級種子園的建園繁殖材料是只經過表現(xiàn)型選擇的優(yōu)樹，未經過子代測定，而且初植密度一般較大，因此在種子園遺傳改良過程中，去劣疏伐是一個重要的管理策略[1-3]。去劣疏伐在提高種子園的遺傳增益的同時，對遺傳多樣性的影響也不容忽視[4]。種子園的遺傳多樣性是林木穩(wěn)定性、抗逆性和進化性的基礎[5]，其群體內總的遺傳變異多樣性越高及與雜合性相關的個體適應性越強，其林分群體相對越穩(wěn)定[6]。種子園的遺傳多樣性是種子園的遺傳基礎[7]，一般來說，在一個有限的種群中，遺傳多樣性一般會隨著種群大小的縮減而減少[8]。有研究表明，去劣疏伐會降低種子園子代群體的遺傳多樣性[9]。

利用SSR分子標記技術，以黑龍江省葦河青山種子園的長白落葉松初級種子園為研究對象，運用群體遺傳學原理，通過對SSR標記多態(tài)位點統(tǒng)計與分析，進行去劣疏伐對種子園遺傳多樣性影響的全面研究，分析不同疏伐強度下遺傳多樣性的變化，以及探討無性系內數量和遺傳多樣性的關系，試圖找出最優(yōu)的去劣疏伐強度和疏伐后各個無性系應保留的單株數量，以維護種子園無性系間以及無性系內的遺傳多樣性，為營建去劣疏伐種子園或1.5代種子園提供親本無性系配置及經營管理的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地點和材料來源

試驗地點位于黑龍江省葦河林業(yè)局青山種子園，長白落葉松初級無性系種子園始建于1983年4月，分為52個小區(qū)，共202個無性系。優(yōu)樹來源均來自綏陽，配置方式為順序錯位法。建園至今，未進行過疏伐。以小區(qū)內包含無性系個數多、單株保存率高為原則選擇試驗地，試驗地設在第28小區(qū)，該小區(qū)面積為0.167了hm2，初植377株，株間距5 m×5 m，實際存活260株，保存率為68.97%，區(qū)內含有38個無性系，每個無性系有1～12株，疏伐時株均高17.67 m、冠幅6.2 m左右，無性系內的雌性球花的花期同步性較好。由于小區(qū)內存活的單株分布不均，大部分植株下部1/4左右冠層有交疊的現(xiàn)象。第28小區(qū)所含的38個無性系中有25個無性系有子代測定林，每個無性系的子代有3～34株，共325株。

該試驗采集第28小區(qū)疏伐前所有單株的當年生（2011.6）嫩葉，每個單株的嫩葉分別置于保鮮袋中，按單株的位置編號，貯于-20℃冰箱備用。

1.2 疏伐設計

對第28小區(qū)所含的38個無性系的子代測定林進行每木檢尺，同時調查第28小區(qū)所有親本（260株）的生長情況。根據調查情況，將親本無性系分為7類，有子代測定林的無性系中，高于平均子代材積20%以上的無性系為A類，高于平均子代材積20%以內的無性系為B類，低于平均子代材積20%以內的無性系為C類，低于平均子代材積20%以上的無性系為D類；無子代測定林的無性系中，平均材積高于親本平均材積的無性系為E類，低于平均親本材積20%以內的無性系為F類，低于平均親本材積20%以上的無性系為G類。

總的疏伐原則為：(1)A類的無性系全部保留；（2）B類的無性系部分疏伐；（3）C、D類的無性系重點疏伐；(4)E類的無性系全部保留；（5）F、G類的無性系，根據親本平均生長情況選擇疏伐；（6）每個無性系內，伐除材積小、不通直、側枝細、結實差的無性系，同時考慮位置。

根據子代表現(xiàn)以及母樹生長結實情況設計疏伐：（1）10%～60%的疏伐強度，預計模擬疏伐后分別保留234株（38個無性系）、208株（36個無性系）、182株（34個無性系）、156株（32個無性系）、130株（30個無性系）、104株（28個無性系），用于不同疏伐強度對遺傳多樣性影響的分析；（2）從A、B、C、D中，分別選取單株數量最多的1個無性系，每一個無性系根據親本生長結實情況設計去劣疏伐，每個無性系每次伐除1株，直到剩下1株，用作無性系內單株數量和遺傳多樣性的關系分析。

1.3 總DNA的提取與SSR-PCR擴增

采用針對落葉松改良的CTAB法[10]提取DNA，0.8%的瓊脂糖凝膠和紫外檢測進行DNA濃度與純度的測定。

SSR-PCR的反應體系：模板DNA50 ng，20μmol·L-1上游引物 2.0 μL，5 μmol·L-1下游引物2.0 μL，2.0 mmol·L-1dNTP（Ta Ka Ra）1.6 μL，10×Taq Buffer 2.0 μL，25 mmol·L-1MgCl22.2μL，5 μ·μL-1Taq DNA 聚 合 酶（Fermentas）0.2μL。PCR擴增反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。反應在System 9700（Gene Amp）擴增儀上進行。

PCR產物混合等體積的上樣緩沖液，94℃變性10 min后用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離片段，銀染拍照并統(tǒng)計結果。

1.4 引物篩選

本研究應用的SSR引物均從已公開的針對落葉松的SSR引物[11-13]，共合成214對SSR引物進行初篩選，選出多態(tài)性高且穩(wěn)定的SSR引物14對（見表1），引物Y14 的部分樣品擴增結果見圖1。

1.5 數據分析

采用人工讀帶法，根據條帶的遷移對其進行判讀，采用A，B，C，D，……記錄電泳條帶。利用軟件POPGENE32計算疏伐前后的遺傳多樣性，分析的參數有：等位基因數（A）、有效等位基因數（Ne）、Shannon多樣性指數（I）、Nei's基因多樣度指數（H）、期望雜合度（He）。

表1 14對SSR引物特征Table 1 Characteristics of 14 SSR primer pairs

2 結果與分析

2.1 疏伐方式與結果

根據子代測定及母樹生長結實情況，同時考慮母樹位置，依據疏伐設計，模擬疏伐，不同疏伐強度設計下各個無性系保留數量情況見表2。具體疏伐情況如下：

10%強度疏伐中，A、B類中的無性系全部保留；C類中的無性系，每個無性系保留8株左右；D類的無性系，每個無性系保留7株左右；E類的無性系全部保留；F、G類的無性系，每個無性系保留8株左右。

20%強度疏伐中，A類中的無性系全部保留；B類中的無性系，每個無性系保留9株左右；C類中的無性系，每個無性系保留7株左右；D類中的無性系，每個無性系保留4株左右；E類中的無性系全部保留；F、G類的無性系保留7株左右，其中438號、264號全部伐除。

30%強度疏伐中，A類中的無性系全部保留；B類中的無性系，每個無性系保留8株左右；C類中的無性系，每個無性系保留6株左右；D類中的無性系，每個無性系保留3株左右，其中474號全部伐除；E類中的無性系全部保留；F、G類的無性系保留5株左右，其中438號、264號、471號全部伐除。

表2 不同疏伐設計下各個無性系保留單株數量情況Table 2 Numbers of reserved clones by different thinning designs

40%強度疏伐中，A類中的無性系全部保留；B類中的無性系，每個無性系保留7株左右；C類中的無性系，每個無性系保留5株左右；D類中的無性系，每個無性系保留3株左右，其中474號、66號全部伐除；E類中的無性系全部保留；F、G類的無性系保留4株左右，其中438號、264號、471號、22號全部伐除。

50%強度疏伐中，A類中的無性系全部保留；B類中的無性系，每個無性系保留6株左右；C類中的無性系，每個無性系保留3株左右；D類中的無性系，每個無性系保留2株左右，其中474號、66號、433號全部伐除；E類中的無性系，每個無性系保留6株；F、G類的無性系保留3株左右，其中438號、264號、471號、22號、29號全部伐除。

60%強度疏伐中，A類中的無性系，每個無性系保留8株；B類中的無性系，每個無性系保留4株左右；C類中的無性系，每個無性系保留2株左右；D類中的無性系全部伐除；E類中的無性系，每個無性系保留5株；F類的無性系，每個無性系保留3株左右；G類的無性系全部疏伐。

無性系內的伐除對象首先考慮不結實或者結實差的無性系，其次是親本材積小的無性系，同時考慮無性系單株的位置。

2.2 不同的疏伐強度對種子園遺傳多樣性的影響

利用篩選出的14對多態(tài)性引物對種子園所有38個無性系共260個單株的DNA進行擴增，檢測到2～7個等位基因，觀察等位基因數（A）均為4.071 4個，有效等位基因數（Ne）為2.325 8。Shannon多樣性指數和Nei's多樣度分別為0.980 5和0.513 6，說明長白落葉松初級種子園育種親本疏伐前具備豐富的遺傳基礎。親本群體平均期望雜合度（He）為0.514 6，說明種子園親本群體中雜合單株較多，純合單株較少（見表3）。

根據疏伐原則，設計10%～60%強度的模擬疏伐，模擬疏伐后，觀察等位基因數沒有隨著疏伐強度的提高而下降，一直為4.071 4。有效等位基因數（Ne）疏伐前為2.325 8，在10%～40%疏伐強度范圍內隨著疏伐強度的增大而緩慢減少，分別為2.322 1、2.320 9、2.315 9、2.314 3，減小幅度在0.5%范圍內；50%疏伐強度時，Ne減小幅度明顯，為2.265 1，降低2.61%；60%疏伐強度時，Ne為2.249 8，減低3.27%。Shannon多樣性指數（I）呈緩慢曲線下降趨勢，疏伐前為0.980 5，10%～60%的疏伐強度疏伐后，分別降為0.977 7、0.977 6、0.972 9、0.968 6、0.953 6、0.938 3。期望雜合度（He）呈緩慢下降的趨勢，疏伐前為0.514 6，10%～40%強度疏伐后分別降為0.512 4、0.512 0、0.508 5、0.507 1，但仍保持種子園內雜合單株較多，50%～60%強度疏伐后，He為0.4997、0.492 1，說明種子園內純合單株多于雜合單株。平均Nei's基因多樣度(H)也呈緩慢下降的趨勢，疏伐前為0.513 6，10%～60%強度模擬疏伐后分別降為0.511 4、0.510 8、0.507 1、0.505 5、0.497 8、0.489 7。

表3 不同疏伐強度的遺傳多樣性的比較Table 3 Comparison of genetic diversity in seed orchard with different thinning intensities

2.3 無性系內數量對遺傳多樣性的影響

根據母樹調查結果，從A、B、C、D類無性系中分別選取38號無性系（10株）、484號無性系（12株）、85號無性系（11株）、248號無性系（10株）。

如圖2所示，4個無性系的觀察等位基因數均隨著無性系內數量的減少而減低，38號無性系的觀察等位基因為3.000 0～1.500 0，66號無性系的觀察等位基因數為3.142 9到1.500 0，85號無性系觀察等位基因數為3.000 0到1.500 0，484號無性系觀察等位基因數為3.000 0到1.571 4，伐后無性系內數量分別降低到6株、7株、7株、7株以下時，降幅增大。

圖2 觀察等位基因和無性系內數量的關系Fig.2 Relation between observative alleles and trees in clone

如圖3所示，無性系內數量對有效等位基因也產生很大的影響，無性系內數量和該無性系有效等位基因數呈正相關，38號無性系的有效等位基因數從1.972 1降到1.500 0，66號無性系的有效等位基因數從2.050 8降到1.500 0，85號無性系的有效等位基因數從2.080 4降到1.500 0，484號無性系的有效等位基因數從2.048 7降到1.571 4。伐后無性系內數量分別降低到7株、9株、9株、7株以下時，降幅增大。

圖3 有效等位基因與無性系內數量的關系Fig.3 Relationp between effective alleles and trees clone

如圖4所示，當無性系內數量在3株以上時，各個無性系內的期望雜合度隨著無性系內的減少而逐漸減少，3株以下呈上升趨勢。32號無性系的期望雜合度分別為0.459 0、0.458 5、0.450 6、0.455 3、0.431 8、0.431 7、0.405 6、0.404 8、0.345 2、0.500 0，66號無性系的期望雜合度分別為0.472 0、0.473 7、0.472 9、0.470 1、0.453 0、0.465 5、0.452 4、0.425 4、0.405 6、0.352 4、0.381 0、0.500 0，85號無性系的期望雜合度分別為0.512 7、0.495 1、0.500 9、0.475 6、0.460 8、0.436 1、0.425 4、0.415 8、0.404 8、0.416 7、0.500 0，484號 無 性系的期望雜合度分別為0.469 5、0.464 1、0.461 3、0.450 5、0.438 3、0.431 7、0.426 0、0.433 3、0.464 3、0.571 4。

如圖5所示，無性系Shannon多樣性指數隨著該無性系內數量的減少而降低，32號無性系的Shannon多樣性指數從0.751 7下降到0.346 6，66號無性系的Shannon多樣性指數從0.796 7降到0.346 6，85號無性系的Shannon多樣性指數從0.823 7降到0.346 6，484號無性系的Shannon多樣性指數從0.779 9降到0.396 1。伐后無性系數量分別降低到7株、9株、7株、7株以下時，降幅增大。

圖4 期望雜合度與無性系內數量的關系Fig.4 Relation between expected heterozygosity and trees in clone

圖5 Shannon多樣性指數與無性系內數量的關系Fig.5 Relation between Shannon Index and trees in clone

圖6 Nei’s基因多樣度與無性系內數量的關系Fig.6 Relation between Nei’s gene diversity and trees in clone

如圖6所示，無性系內Nei's基因多樣度也隨著無性系內數量的減少而減低。32號無性系的Nei's基因多樣度為0.436 1～0.250 0，66號無性系的Nei's基因多樣度為0.452 4～0.250 0，85號無性系的Nei's基因多樣度為0.489 4～0.250 0，484號無性系的Nei's基因多樣度為0.446 1～0.285 7。伐后無性系數量分別降低到7株、7株、9株、7株以下時，降幅增大。

3 結論與討論

本研究分析結果表明長白落葉松初級無性系種子園依據無性系的子代表現(xiàn)及親本生長結實能力對其實施去劣疏伐，在一定程度上減少種子園的遺傳多樣性，而且種子園遺傳多樣性降低程度與疏伐強度呈正相關。小于40%疏伐強度的疏伐，有效等位基因與疏伐前基本一致，降幅小于0.5%，期望雜合度在0.5以上，說明能維持種子園親本較高的雜合度，而50%、60%的疏伐強度，有效等位基因數降幅增大，分別下降了2.61%、3.27%，期望雜合度下降到0.5以下，因此，建議長白落葉松初級無性系種子園疏伐強度在40%疏伐強度以內。

無性系內觀察等位基因、有效等位基因、Shannon多樣性指數、Nei's基因多樣度總趨勢都是隨著無性系內數量的減少而減少，但當到某一點后，下降的趨勢明顯增大，這拐點一般在7～9株之間。綜上分析，去劣疏伐后每個無性系至少應保留7～9株，以維持無性系內的遺傳多樣性。如按照疏伐后保存率為60%推算，長白落葉松種子園建園時，每個無性系至少種植12～15株。

松科其他樹種有去劣疏伐對種子園遺傳多樣性影響的報道，油松種子園進行1/3強度去劣疏伐后，以疏伐前（1993年）和疏伐后不連續(xù)2年（1996、2000年）的油松種子為試驗材料，表明每個位點的平均等位基因數減少7%和17%，多態(tài)位點百分率下降20%和17%[9]，反映了去劣疏伐對油松種子園子代遺傳多樣性影響。美國白松兩個250年生天然林經3/4強度疏伐后，檢測到的等位基因數都減少了約25%，多態(tài)位點百分率降低了33%，由于疏伐造成兩個林分各約40%的低頻等位基因和80%的稀有等位基因丟失[14]。 Lindgren[15]、Kyu-Suk Kang[16]、陳建中[17]采用狀態(tài)數的方法，分析表明去劣疏伐在增加種子園的遺傳增益的同時，降低了種子園育種群體的遺傳多樣性。

本研究是基于長白落葉松初級無性系種子園的一個小區(qū)的全部親本單株模擬疏伐前后的調查統(tǒng)計結果，避免了抽樣調查對實驗結果產生的誤差，真實地反映了不同疏伐強度及無性系內不同數量對該種子園生產小區(qū)遺傳多樣性的影響。同時，有利今后關于該種子園小區(qū)子代遺傳多樣性、園內交配系統(tǒng)的對比研究，探索親本遺傳多樣性與子代遺傳多樣性的關系。

以往的去劣疏伐側重獲得較高的遺傳增益，在未來的種子園發(fā)展中將會更加重視遺傳增益和遺傳多樣性之間的平衡，種子園內各個家系或者無性系內數量的不同，能更好地維持這種平衡。在制定種子園去劣疏伐的策略時，家系或無性系間的親緣關系以及家系或無性系的子代表現(xiàn)也應是需要考慮的內容[18-21]。

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Effects of rogue thinning on genetic diversity by SSR in a Larix olgensis clone seed orchard

YAO Yu, ZHANG Han-guo, ZHANG Zhen, ZHANG Lei
(State Key Lab. of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, Heilongjiang, China)

To fi nd out the changes of genetic diversity in the Larix olgensis Henry elementary clone seed orchard after rogue thinning, the genetic diversity of 38 L. olgensis clones (260 individuals) in Qingshan orchard were studied by using 14 pairs SSR primers. According to the individuals’ ability of growth, bearing and their progeny, the simulation thinning activities with intensity from 10% to 60% were conducted, and the changes of genetic diversity parameters before and after thinning were analyzed by POPGENE3.2. The results show that the reduction level of genetic diversity was positive correlation with the thinning intensity, the thinning intensity less than 40%affected genetic diversity of clones slightly (reduction was less than 0.5%) and can maintain the orchard’s broad base of genetic. If the genetic diversity of one clone is preserved, at least 7～9 individuals need to be reserved, in accordance with the preservation rate of 60%after thinning, at the beginning of building a L. olgensis orchard, each L. olgensis clone needs to consist of more than 12～15 individuals.

Larix olgensis Henry; seed orchard; SSR makers; genetic diversity; rogue thinning

S791.229；S722.8+3

A

1673-923X(2013)03-0040-07

2012-12-10

科技部基礎專項“東北林木良種基地種質資源現(xiàn)狀調查”(2007FY110400-3)

姚 宇（1988-），女，遼寧鞍山人，碩士研究生，主要從事林木遺傳多樣性研究

張含國（1962-），男，黑龍江哈爾濱人，教授，博士，從事林木遺傳改良等研究；E-mail：hanguozhang1@yahoo.com.cn

[本文編校：謝榮秀]