HBV感染對乳頭狀甲狀腺癌臨床病理及分子生物學(xué)特征影響

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(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 青島 266003； 2 青島市市立醫(yī)院； 3 北京協(xié)和醫(yī)院)

越來越多的研究表明,甲狀腺疾病與乙型肝炎間存在著密切的關(guān)系。甲狀腺自身免疫性疾病和乙型肝炎均參與以甲狀腺為靶器官的細胞和體液免疫反應(yīng)[1]。有研究在甲狀腺組織中檢測到乙型肝炎病毒(HBV)的DNA序列[2]。BRAFV600E突變和RET癌基因在乳頭狀甲狀腺癌(PTC)的發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。本文研究HBV是否對BRAFV600E突變和RET蛋白表達產(chǎn)生影響，進而探討其與PTC的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年6月—2012年6月北京協(xié)和醫(yī)院手術(shù)切除PTC標本184例，病人男52例，女132例，平均年齡(42±12)歲。感染HBV者66例(A組)，未感染HBV者118例(B組)。所有標本均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診。

1.2 檢測指標及方法

1.2.1臨床特征 統(tǒng)計所有研究對象的性別、確診年齡、腫瘤大小、是否多發(fā)病灶(≥2個病灶)、TNM分期、包膜外浸潤情況、橋本病及結(jié)節(jié)甲狀腺病并發(fā)情況。

1.2.2BRAFV600E突變檢測 取石蠟包埋的腫瘤組織(多發(fā)病灶取最大者)，行蘇木精-伊紅(HE)染色，確定腫瘤區(qū)域。提取DNA，按照試劑盒(QIA-amp DNA FFPE Tissue Kit)說明書進行操作。采用實時定量PCR方法進行基因檢測。BRAF的第15外顯子的引物序列：上游為5′-TCATAATGCT-TGCTCTGATAGGA-3′;下游為5′-GGCCAAAA-ATTTAATCAGTGGA-3′。PCR反應(yīng)體系25 μL，內(nèi)含cDNA模板200 ng,0.2 mmol/L的dNTP,引物10 mmol/L,Tris-Hcl(pH 8.3),2.5 mmol/L的MgCl2,1 U的TaqDNA聚合酶及雙蒸水。反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min,94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延長30 s,40個循環(huán)后,72 ℃延長10 min。取PCR擴增產(chǎn)物6 μL，在25 g/L瓊脂糖凝膠中電泳1 h，在凝膠圖像分析儀上觀察結(jié)果。

1.2.3RET蛋白檢測 采用免疫組化方法。所有標本均連續(xù)切片, 厚度為4 μm。 RET蛋白表達檢測應(yīng)用RET蛋白試劑盒(Santa Cruz公司產(chǎn)品), DAB 顯色試劑盒(購于武漢博士德生物工程公司)顯色，操作步驟按試劑盒說明書進行, 用PBS 代替一抗作陰性對照，用已知的陽性組織作為陽性對照。RET結(jié)果判定: 400倍顯微鏡下觀察，腫瘤細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色,根據(jù)陽性染色腫瘤細胞數(shù)占總腫瘤細胞數(shù)的百分比及其染色強度分別評分。百分比評分：陽性細胞百分比<10%為1分,陽性細胞百分比10%～40%為2分，陽性細胞百分比41%～70%為3分，陽性細胞百分比>70%為4分。染色強度評分：腫瘤細胞未見染色為0分,弱染色為1分,中等程度染色為2分,強染色為3分。將百分比評分與染色強度評分相乘,得分0～7分為陰性,8～12分為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床病理特征比較

A組結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的檢出率高于B組，差異有顯著性(χ2=5.33，P<0.05)；兩組橋本病的檢出率差異無顯著性(P>0.05)。兩組診斷年齡、腫瘤大小、多發(fā)病灶、包膜外浸潤、頸部淋巴結(jié)浸潤、遠處轉(zhuǎn)移情況比較，差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1 A組和B組病人臨床病理特征的比較(例(χ/%))

2.2 兩組BRAFV600E突變率比較

PTC病人184例,檢測到BRAFV600E突變107例,突變率58.2%，其中A組突變率為56.1%(37/66),B組為59.3%(70/118),兩組比較差異無顯著性(P>0.05)。

2.3 兩組RET蛋白表達比較

PTC組織RET蛋白陽性染色主要分布在甲狀腺癌細胞胞漿,細胞核無染色，陽性表達率為45.7%(84/184)。A組RET蛋白陽性表達率為40.9%(27/66),B組為48.3%(57/118),兩組間比較差異無顯著性(P>0.05)。

3 討 論

乙型病毒性肝炎是一種世界范圍傳染性疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球約20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝癌(HCC)。慢性乙型肝炎在我國有著較高的發(fā)病率,我國目前的HBsAg陽性人口占總?cè)丝诘?0%～15%，5%～10%發(fā)展為慢性感染，甚至演變成肝硬化、肝癌,嚴重危害著我國國民的健康。甲狀腺惡性腫瘤是頭頸部常見的惡性腫瘤,是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的一類惡性腫瘤。PTC是發(fā)病率最高的甲狀腺惡性腫瘤,占甲狀腺癌的70%～80%,占全身惡性腫瘤的1%～2%[3]。肝臟發(fā)生病變會影響下丘腦-垂體-甲狀腺軸的調(diào)控功能，導(dǎo)致血清中甲狀腺激素水平的變化，從而出現(xiàn)甲狀腺功能障礙[4]。HBV不僅能引起慢性肝炎、肝硬化及肝細胞癌，還能引起一系列的肝外病變。研究結(jié)果顯示, 乙型肝炎病人血清甲狀腺激素含量異常, 可能與肝炎病毒的泛嗜性和病毒直接侵害甲狀腺功能有關(guān)[5]。有研究結(jié)果顯示，HBV與甲狀腺自身免疫性疾病有關(guān)[1]，甲狀腺自身免疫性疾病和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫增加患PTC的風(fēng)險[6]。因此，針對HBV感染對PTC發(fā)病的影響的研究越來越引起人們的重視。那么，HBV是否會對BRAFV600E、RET基因產(chǎn)生影響，從而進一步推動PTC的發(fā)生、發(fā)展，至今尚無定論。

本文對比了HBV感染和非感染PTC病人的臨床、病理及分子生物學(xué)特點,結(jié)果顯示，PTC合并HBV感染病人結(jié)節(jié)性甲狀腺腫檢出率高于無HBV感染者，差異有顯著性。既往研究顯示，肝炎病毒具有泛嗜性，并可直接損害甲狀腺功能[5]，從而導(dǎo)致人體內(nèi)甲狀腺激素相對不足，致使垂體TSH分泌增多，在增多的TSH長時期的刺激下，甲狀腺反復(fù)增生，伴有各種退行性變，最終形成結(jié)節(jié)。因此我們推測，HBV感染引起病人血清甲狀腺激素含量減低，導(dǎo)致TSH分泌增多是PTC合并HBV感染病人結(jié)節(jié)性甲狀腺腫高發(fā)的原因[7]。HBV急性感染、慢性感染及乙型肝炎肝硬化等情況下的甲狀腺激素水平的變化，需要進一步的研究。

本文合并HBV感染的PTC病人橋本病檢出率也有增高的趨勢，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義。橋本病屬于自身免疫性疾病，病毒感染是其發(fā)病原因之一。橋本病的人群發(fā)病率不高，而本研究樣本例數(shù)較少，需要擴大樣本量進一步研究。

絲裂原活化的蛋白激酶(MAPK)通路的激活與PTC的發(fā)生和進展有密切關(guān)系，而BRAF激酶的突變在Raf激酶中能最有效地激活MAPK通路[8]。XING等[9]的研究顯示，PTC組織BRAFV-600E突變率為44%。本文研究結(jié)果顯示，PTC組織BRAFV600E突變率為58.2%，與其報道相符。RET基因與其他基因能形成多種融合基因(RET/PTC-1,RET/PTC-2,RET/PTC-3等),也能激活MAPK信號通路并可能與癌變有關(guān)[10-12]。而RET基因重排在PTC病人中也非常普遍,其發(fā)生率可達2.5%～100%[13]。本文的研究結(jié)果顯示，PTC組織RET蛋白陽性表達率為45.7%，與上述報道相符。本研究沒有發(fā)現(xiàn)HBV感染與BRAFV600E突變和RET蛋白表達的相關(guān)性，但HBV感染與PTC其他相關(guān)基因的相關(guān)性有待進一步的研究。

總之，本研究結(jié)果顯示，HBV感染的PTC病人結(jié)節(jié)性甲狀腺腫檢出率較非HBV感染者更高；橋本病也有類似的趨勢，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義。由于甲狀腺自身免疫性疾病和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫增加患PTC的風(fēng)險[6]，因此，我們推測HBV感染可能是PTC的潛在危險因素。本研究結(jié)果未顯示HBV感染與腫瘤大小、多發(fā)病灶、包膜外浸潤、頸部淋巴結(jié)浸潤、遠處轉(zhuǎn)移、BRAFV600E突變及RET基因表達的相關(guān)性，但由于存在地區(qū)限制和樣本量少，故需要進一步對HBV感染與PTC臨床病理及分子生物學(xué)特點的相關(guān)性進行研究。

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