咽炎飲對咽炎大鼠血液流變學(xué)和炎癥因子的影響

段美秀，王志義 （.遼寧醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，遼寧 錦州00；.錦州石化醫(yī)院，遼寧 錦州00）

咽炎是常見的上呼吸道疾病，由于氣候變化、生活條件和工作環(huán)境等的影響，發(fā)病率正逐年上升，尤其在季節(jié)變換的時候，又以吸煙者居多。有單一采用中藥湯劑或中成藥的動物實驗研究，也有聯(lián)合抗菌藥或地塞米松的治療研究。而抗菌藥的長期或反復(fù)應(yīng)用，容易引起咽部菌群失調(diào)，造成咽炎易發(fā)，不利于根治。同時，針對上感等易引發(fā)咽炎的疾病和咽炎易感人群，用于預(yù)防的藥物研究甚少。中醫(yī)認(rèn)為“咽喉為肺之關(guān)，胃之門”，因而研究咽炎的發(fā)生發(fā)展、有效防治咽炎在臨床上顯得尤為重要。咽炎飲是錦州石化醫(yī)院院內(nèi)處方，由金銀花20 g、連翹20 g、板藍(lán)根30 g、薄荷10 g、麥冬15 g等組成，開水泡服，簡便易行，加入薄荷、金銀花等改善口感，氣味芳香，諸藥合用清熱利咽、滋陰、消腫，清中有補，適于廣大咽炎患者的治療和預(yù)防。本實驗對大鼠急性咽炎模型予以咽炎飲灌胃，考察咽炎飲的效用和作用機制，以豐富臨床治療。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 雙黃連口服液（哈藥集團三精制藥，批號100902）；大 鼠 TNF－α（批 號20110429）、IL－1β（批 號20110424）試劑盒，購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；兔抗大鼠MMP－2（批號BA1173）、MMP－9（批號BA1178）抗體均購自北京博奧森公司。

1.2 咽炎飲藥物配備 咽炎飲組方為金銀花、連翹、板藍(lán)根、大青葉、麥冬、蒲公英、薄荷等（錦州石化醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)鋒教授鑒定為正品）。將1劑咽炎飲中的板藍(lán)根、連翹、麥冬研末，與金銀花、薄荷等一起置于500 mL的廣口瓶中，加入沸水350 mL，密封浸泡20 min（每5 min搖勻1次）后，封閉過濾取濾液，向濾渣中再加沸水350 mL，浸泡搖勻20 min同前，過濾后合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成136 mL（相當(dāng)于生藥1.8 g·mL－1）藥液，4 ℃存放，備用。

1.3 實驗動物、模型制備及分組 清潔級SD 雄性大鼠50只，體質(zhì)量200～250 g，遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（遼）2003－0007。

從實驗動物中心領(lǐng)取大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為5 組：空白組、模型組、雙黃連組、治療給藥組和預(yù)防給藥組，每組10 只。除空白組外，其余4組給予15%濃氨水噴咽，bid，每次3掀，連續(xù)3 d［1］。預(yù)防組每次造模前10 min給予咽炎飲2 mL灌胃，bid，余組正常喂養(yǎng)。造模成功后，給予雙黃連2 mL（雙黃連組）、咽炎飲2 mL（治療組）灌胃，預(yù)防組繼續(xù)灌胃如前，連續(xù)1周，每日記錄大鼠一般狀態(tài)。

1.4 血液流變學(xué)檢測 上述處理后，全部大鼠禁食水12 h，次日晨起稱重，腹腔20% 烏拉坦（5 mL·kg－1·d－1））麻醉。開胸，于心尖處取血4 mL后進行檢測。

1.5 ELISA 檢測TNF－α、IL－1β含量 100 mg組織制成勻漿，提取上清液→稀釋標(biāo)準(zhǔn)品→標(biāo)準(zhǔn)品孔加入標(biāo)準(zhǔn)品50μL和鏈霉親和素－HRP50μL，樣品孔加入組織上清液40μL、鏈霉親和素－HRP50μL 和生物素標(biāo)記二抗10μl，混勻，37℃反應(yīng)60 min→30倍濃縮洗滌液用30倍純化水稀釋，重復(fù)洗板5 次，拍干→每孔先后加入50μL顯色液A、B，混勻，37℃避光顯色10 min→每孔加入50μL 終止液→10 min之內(nèi)，以空白孔調(diào)零，于450 nm 波長處測各組吸光度（OD 值）并記錄。

1.6 Western－Blot測定MMP－2 和MMP－9 表達 100 mg組織加入裂解液剪碎，移入EP管中，超聲粉碎，4 ℃、12 000 r·min－1離心25 min，取上清液測蛋白含量。各取等量的樣本進行SDS－PAGE電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V，半干法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，TBS 沖洗，封閉，TBS沖洗，將膜放入一抗（1∶500稀釋）中，4 ℃過夜。TTBS沖洗后，將膜放入二抗（1∶500稀釋）中，室溫孵育1～2 h，然后TTBS洗膜3次，每次10 min，NBT／BCIP 顯色液中避光顯色，直至出現(xiàn)，終止反應(yīng)。掃描蛋白印跡顯影圖，利用凝膠自動分析成像軟件Chem Image 5500 對蛋白帶進行分析。以各組MMP－2、MMP－9表達與內(nèi)參表達比值表示MMP－2、MMP－9的相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài) 模型組大鼠食量減少，飲水增多，呼吸加快，聲音嘶啞，嚴(yán)重者可聞及痰鳴音。肉眼可見咽部紅腫，有黃白潰瘍點，附著透明黏稠分泌物。

2.2 血液流變學(xué)檢測結(jié)果 模型組各指標(biāo)較空白組均有升高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其他組與模型組相比（P＜0.05），說明咽炎飲和雙黃連都是有效的。而與雙黃連組比較，治療組和預(yù)防組多數(shù)指標(biāo)略有下降，只有全血還原黏度比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明咽炎飲改善咽炎大鼠微循環(huán)的效果顯著，比雙黃連療效略好。見表1、表2。

表1 咽炎飲對大鼠咽炎血液流變學(xué)的影響±s，n＝10）Tab 1 Effects of pharyngitis drink on blood rheology in pharyngitis rats±s，n＝10）

表1 咽炎飲對大鼠咽炎血液流變學(xué)的影響±s，n＝10）Tab 1 Effects of pharyngitis drink on blood rheology in pharyngitis rats±s，n＝10）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與雙黃連組比 較，c P＜0.05

組別 全血黏度／m Pa·s 全血還原黏度／m Pa·s高切（150 s－1）低切（1 s－1）高切（150 s－1） 低切（1 s－1）空白組 4.8±0.5bc 11.6±0.4b 7.6±0.4bc 25.90±0.32 bc模 型 組 7.6±0.9ac 12.7±0.7ac 8.6±0.5a 6.7±0.5ac雙黃連組6.0±0.8ab 11.7±0.4b 8.3±0.4a 26.6±0.4ab治療組 5.9±0.7ab 11.7±0.4b 8.09±0.32bc 26.5±0.4ab預(yù)防組 6.0±1.9ab 11.7±0.4b 8.1±0.4bc 26.48±0.34 bc

表2 咽炎飲對大鼠咽炎血液流變學(xué)各指標(biāo)的影響±s，n＝10）Tab 2 Effects of pharyngitis drink on the parameters of blood rheology in pharyngitis rats±s，n＝10）

表2 咽炎飲對大鼠咽炎血液流變學(xué)各指標(biāo)的影響±s，n＝10）Tab 2 Effects of pharyngitis drink on the parameters of blood rheology in pharyngitis rats±s，n＝10）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與雙黃連組比 較，c P＜0.05

組別 血漿黏度／mPa·s紅細(xì)胞壓積／%紅細(xì)胞聚集指數(shù)紅細(xì)胞剛性指數(shù)空白組 1.39±0.26b 44.3±0.7bc 2.77±0.32b 6.6±0.8 bc模型組 1.86±0.33ac 48.0±0.6a 3.1±0.4ac 7.6±1.1a雙黃連組1.5±0.4b 47.6±0.7a 2.64±0.25b 7.1±0.6a治療組 1.6±0.4b 47.1±0.6ab 2.6±0.4b 6.8±0.8b預(yù)防組 1.6±0.25ab 47.4±0.8ab 2.6±0.4b 7.3±0.8 ab

2.3 ELISA 檢測TNF－α、IL－1β結(jié)果 與空白組比較，模型組TNF－α、IL－1β顯著增多（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；經(jīng)咽炎飲預(yù)防和治療給藥后TNF－α、IL－1β減少（P＜0.05），說明咽炎飲抑制炎癥因子釋放，對抗大鼠咽炎的效果顯著；與雙黃連組比較（P＜0.05），療效較雙黃連更好。見表3。

2.4 Western－Blot測定MMP－2、MMP－9表達的結(jié)果 模型組MMP－2、MMP－9表達較空白組增強（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；經(jīng)咽炎飲預(yù)防和治療給藥后均有MMP－2、MMP－9表達減弱（P＜0.05）；與雙黃連組療效比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明咽炎飲抑制蛋白表達比雙黃連效果更好，對抗大鼠咽炎有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1和表4。

表3 咽炎飲對咽炎大鼠TNF－α和IL－1β的影響±s，n＝10）Tab 3 Effects of pharyngitis drink on TNF－αand IL－1βin pharyngitis rats±s，n＝10）

表3 咽炎飲對咽炎大鼠TNF－α和IL－1β的影響±s，n＝10）Tab 3 Effects of pharyngitis drink on TNF－αand IL－1βin pharyngitis rats±s，n＝10）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與雙黃連組比 較，c P＜0.05

組別 TNF－α／ng·L－1 IL－1β／ng·L－1空白組 40.6±7.6bc 56.5±11.2 bc模型組 88.3±9.4ac 94.3±10.5ac雙黃連組 50.9±9.8ab 67.9±9.8ab治療組 48.5±7.6b 60.3±7.6b預(yù)防組 75.6±8.2bc 78.9±8.7 bc

圖1 各組大鼠MMP－2和MMP－9的表達1－空白組；2－模型組；3－雙黃連組；4－治療組；5－預(yù)防組Feg 1 The expression of MMP－2 and MMP－9 of Rats in each group 1－blank group；2－model group；3－shuanghuanglian－group；4－treatment group；5－prevention group

表4 咽炎飲對咽炎大鼠MMP－2和MMP－9表達的影響±s，n＝10）Tab 4 Effects of pharyngitis drink on the expression of MMP－2 and MMP－9 in pharyngitis rats±s，n＝10）

表4 咽炎飲對咽炎大鼠MMP－2和MMP－9表達的影響±s，n＝10）Tab 4 Effects of pharyngitis drink on the expression of MMP－2 and MMP－9 in pharyngitis rats±s，n＝10）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與雙黃連組比 較，c P＜0.05

組別 AMMP－2／Aβ－actin AMMP－9／Aβ－actin空白組 0.42±0.25bc 0.35±0.08 bc模型組 1.02±0.14ac 0.96±0.35ac雙黃連組 0.77±0.05ab 0.78±0.12ab治療組 0.65±0.10abc 0.55±0.06bc預(yù)防組 0.54±0.04bc 0.57±0.03 bc

3 討論

咽下接食道，與胃相通，司飲食吞咽；下接氣道，與肺相通，共同行呼吸和發(fā)音。模型組大鼠咽部紅腫，有潰瘍，附著透明黏稠分泌物，屬熱毒蘊結(jié)證［2］，故食量減少，呼吸加快，聲音改變。咽炎蔓延，紅細(xì)胞因表面電荷失衡而聚集，且咽部長時間異物刺激產(chǎn)生代謝性毒物使紅細(xì)胞功能受損、變形性降低，使血液呈“高黏狀態(tài)”［3］。血液黏度愈高，流變性愈小，流速愈慢，流量愈少［4］。如表1、2 所示，與模型組比較，經(jīng)過咽炎飲灌胃，血液的黏、凝、聚改變明顯減輕（P＜0.05），表明咽炎飲能有效改善咽炎。

炎癥反應(yīng)早期，單核一巨噬細(xì)胞即釋放TNF－α，隨炎癥蔓延，TNF－α 亦增多，在炎癥反應(yīng)過程中起著重要作用。TNF－α既可作用于其他免疫細(xì)胞和免疫輔助細(xì)胞，也可誘生其自身及IL－1 等細(xì)胞因子，促進炎癥反應(yīng)清除病原［5］。咽炎發(fā)病時，作為炎癥反應(yīng)主要介質(zhì)的的IL－1β增多，通過刺激造血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增殖分化，抑制金屬蛋白酶組織抑制因子，調(diào)節(jié)宿主對微生物感染的免疫反應(yīng)及參與細(xì)胞外基質(zhì)的分解代謝，在咽炎發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。同時，IL－1β誘導(dǎo)單核—巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更多的TNF－α和IL，促進黏附因子和趨化性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進而引起單核細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞的聚集與浸潤［6］。如表3 所示：與空白組比較，模型組TNF－α、IL－1β分泌明顯增多，而經(jīng)咽炎飲灌胃者TNF－α、IL－1β分泌顯著減少（P＜0.05），且較雙黃連更能減少TNF－α、IL－1β分泌，抑制炎癥蔓延。

正常組織只有少量的MMP，炎性細(xì)胞侵入后便成為MMP的生產(chǎn)來源。同時，TNF－α、IL－1β的釋放可誘導(dǎo)MMP合成［7］。炎性細(xì)胞浸潤，與炎性因子相互誘導(dǎo)影響MMP的表達。MMP－2、MMP－9是水解變性膠原及基膜的主要成分，可影響酶與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用。有文獻報道，抑制MMP－2可有效減輕組織破壞及炎癥過程［8］。綜上所述，咽炎飲對大鼠咽炎既有治療作用，又有預(yù)防作用，且療效較雙黃連為好。其作用機制可能與改善微循環(huán)和抑制炎癥因子分泌有關(guān)，具體機制有待進一步研究。

［1］ 高瑞寧，陳燕，陳兆全.清咽噴霧劑對急性咽炎治療作用的實驗研究［J］.中醫(yī)研究，2009，22（1）：19－21.

［2］ 王付，怎樣分型辨治慢性咽炎［J］，中醫(yī)雜志，2011，（1）：65.

［3］ 彭順林，鄧謙，鄧曉筑，慢性咽炎血液流變學(xué)實驗觀察［J］.中國血液流變學(xué)雜志，2003，（13）2.

［4］ 彭順林，鄧謙，利咽口服液對實驗性慢性咽炎模型動物的血液流變學(xué)的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合耳鼻喉科雜志2004，12（2）：57－59.

［5］ 袁偉鋒，黃文杰，TNF－α基因單核核酸多態(tài)性與肺炎的相關(guān)性研究［D］.南方醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文，2008.

［6］ 常春榮，潘亞萍.冠心病伴牙周炎患者在牙周基礎(chǔ)治療前后血清及齦溝液中丁TNF－α、IL－1β及IL－6水平的變化［D］.中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文，2009.

［7］ 張莉，楊持.MMP－2和CRP 在咽炎動物模型中的表達與意義［J］.中華實驗與臨床感染病雜志，2009，3（3）：259－264.

［8］ 陳錫美，劉文濱，陳文駿，等.潰瘍性結(jié)腸炎患者基質(zhì)金屬蛋白酶2、9和抑制因子1、2 的表達及意義［J］.中國內(nèi)科雜志，2003，20：384－386.