鈍齒棒桿菌產乳酸與琥珀酸的代謝調控

陳小舉，姜紹通*，李興江，潘麗軍

(合肥工業(yè)大學農產品加工研究院，生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009)

乳酸和琥珀酸廣泛應用于食品、化工和醫(yī)藥等產業(yè)[1-2]。隨著時代的發(fā)展，人類越來越注重環(huán)境的保護，生物可降解材料的制備也因此受到了極大的關注[3-4]。作為聚乳酸和聚琥珀酸丁二酯的合成前體，乳酸和琥珀酸的生產一直是研究的熱點。目前，主要通過化學方法制備琥珀酸，但化學法制備琥珀酸會對環(huán)境造成污染，使其廣泛應用受到了限制[5]。近年來，微生物轉化再生資源制備琥珀酸的方法倍受重視。通過微生物轉化可再生資源和CO2制備琥珀酸，不僅可以擺脫對石化原料的依賴，而且還能開辟利用溫室氣體CO2的新途徑。工業(yè)規(guī)模的微生物轉化可再生資源和CO2制備琥珀酸將成為一個最具發(fā)展?jié)摿Φ木G色工藝模式[6]。

本研究小組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，將鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)在厭氧環(huán)境下進行培養(yǎng)時產生的代謝物為主要乳酸和琥珀酸。與乳酸相比，琥珀酸的產量較低，無法做到聯(lián)產乳酸和琥珀酸。在厭氧環(huán)境下，與C. crenatum基因同源性很高的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)主要利用兩種途徑生產琥珀酸(圖1)：第一條途徑為C4途徑，即由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)到草酰乙酸，然后再通過TCA循環(huán)的還原途徑(由草酰乙酸經蘋果酸、富馬酸到琥珀酸)產生琥珀酸；第二條途徑為乙醛酸循環(huán)[7]。其中，第一條途徑為生產琥珀酸的主要途徑，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是這個途徑中的關鍵酶，其酶活的高低對PEP節(jié)點處碳代謝流的分布有較大的影響。PEPC是一種羧化酶，可將PEP催化生成草酰乙酸，此反應須固定一分子CO2。改變發(fā)酵體系中CO2的濃度及其供應方式會對PEPC的活性和PEP節(jié)點處的代謝流分布產生影響，進而實現(xiàn)調控羧化反應下游產物的生成，如琥珀酸等[8]。鈍齒棒桿菌代謝模型中包括的生化反應方程如表1所示。

圖 1 厭氧條件下鈍齒棒桿菌的代謝網絡Fig.1 Metabolic networks of C. crenatum under anaerobic conditions

通過向發(fā)酵體系中加入碳酸氫鈉，可以為C. crenatum提供羧化反應所需的CO2，強化羧化反應的進行，進而調節(jié)乳酸和琥珀酸的生成比，達到增加琥珀酸產量的目的及實現(xiàn)乳酸和琥珀酸的聯(lián)產。代謝通量分析是代謝工程研究中最重要的一種手段和方法[9]。本實驗在代謝途徑分析及代謝通量計算的基礎上，調控C. crenatum細胞內PEP節(jié)點處的代謝流分布，調節(jié)乳酸和琥珀酸的生成比，為利用C. crenatum轉化可再生資源聯(lián)產乳酸和琥珀酸提供數(shù)據支持。

表 1 鈍齒棒桿菌代謝模型中包括的生化反應方程Table 1 Metabolic reactions in C. crenatum metabolic networks

1 材料與方法

1.1 菌株

Corynebacterium crenatum CICC20219 本實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖40g/L、尿素2g/L、酵母提取物2g/L、酪蛋白氨基酸7g/L、(NH4)2SO47g/L、KH2PO40.5g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeSO4·7H2O 6mg/L、MnSO4·H2O 4.2mg/L、生物素0.2mg/L、硫胺素0.2mg/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖48g/L、KH2PO40.5g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeSO4·7H2O 6mg/L、MnSO4·H2O 4.2mg/L、生物素0.2mg/L、硫胺素0.2mg/L。加入NaHCO3，使?jié)舛确謩e為0、10、100、200mmol/L。

1.3 儀器與設備

ELSD 2424、UV 2996高效液相色譜系統(tǒng)、糖檢測色譜柱 美國Waters公司；有機酸檢測色譜柱 德國Merck公司；GA92-ⅡD超聲波細胞破碎機 無錫上佳生物技術公司。

1.4 培養(yǎng)方法

挑取單菌落C. crenatum接種于含30mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30℃、200r/min培養(yǎng)12h。然后以10%的接種量轉接于含1.5L種子培養(yǎng)基的3L發(fā)酵罐中，30℃、300r/min培養(yǎng)10h，通氣量為2.0L/(L·min)，pH值為7.5，中和劑為5mol/L NaOH。然后5000r/min、4℃離心10min，去掉上清液收集菌體。將收集后的菌體接種于含1.5L發(fā)酵培養(yǎng)基的3L發(fā)酵罐中，使生物量為10g/L左右，通入氮氣，持續(xù)5min。然后密封發(fā)酵罐，30℃、150r/min厭氧發(fā)酵，pH值為7.2，中和劑為5mol/L NaOH。每組實驗均重復3次。

1.5 檢測方法

將發(fā)酵液樣品于4℃、10000r/min離心10min，取上清液用于糖、有機酸等物質的分析。糖和有機酸均采用高效液相色譜法(HPLC)分析。糖檢測色譜柱為Carbohydrate Analysis (3.9mm×300mm)，采用蒸發(fā)光檢測器ELSD2424，流動相為75%乙腈，流速1.000mL/min。有機酸檢測色譜柱為Purospher STAR C18(250mm×4.6mm，5μm)，采用紫外檢測器UV2996，流動相為5mmol/L H2SO4，流速為1.000mL/min。每組數(shù)據測3次，實驗誤差在5%以內。

1.6 生物量測定

生物量以OD610nm表示。細胞干質量(DCW)采用恒質量法測定[10]。

1.7 酶活力檢測

取1mL發(fā)酵培養(yǎng)菌懸液于4℃、10000r/min離心10min獲得菌體，用含15%甘油的Tris-HCl (50mmol/L，pH 7.5) 洗滌2次，使用超聲波細胞破碎機冰浴超聲90次(超聲2s/間隔5s)，功率為200W。4℃、10000r/min冷凍離心15min，上清液即為原始粗酶液。

PEPC酶活力的檢測方法如文獻[11]所述。一個酶活力單位(1U)定義為每分鐘催化1μmol/L底物所需要的酶量，單位為U/mg。

1.8 蛋白質含量檢測

總蛋白質含量的測定采用Bradford法[12]。

1.9 代謝通量計算

代謝網路的建立：因為關于C. crenatum代謝網路的相關文獻資料鮮見，尤其在厭氧條件下的代謝特征更無相關報道。因此，本實驗參照與C. crenatum基因同源性高達99%的C. glutamicu的代謝網絡[7,13-14]，構建其代謝網絡模型，如圖1所示。

代謝流計算：在代謝流計算過程中，統(tǒng)一取發(fā)酵時間為1～3h時間段的發(fā)酵液進行代謝分析。在此時間段內，其代謝產物的生成速率比較穩(wěn)定，而且這一部分時間內的平均值與細胞總體發(fā)酵的平均值比較接近，各個發(fā)酵批次之間重現(xiàn)性好，所以統(tǒng)一考察該時間段變量。在代謝產物精確檢測的條件下，結合C. crenatum在厭氧條件下的主代謝途徑，能夠推測出其代謝過程，并且利用擬穩(wěn)態(tài)假設的方法，可以求出各個途徑的代謝通量。

化學計量平衡式列于附錄。節(jié)點數(shù)(變量)為27個，方程數(shù)為22個，方程自由度5，需要測定5個變量方可計算代謝網絡中的代謝流分布。在C. crenatum厭氧發(fā)酵條件下，本實驗離線檢測胞外代謝物為葡萄糖、乳酸、琥珀酸、乙酸和丙酮酸。

2 結果與分析

2.1 NaHCO3對C. crenatum產酸的影響

本實驗細致研究了NaHCO3對葡萄糖消耗速率、乳酸和琥珀酸生成速度及其產量的影響。由圖2和表2、3可以看出，厭氧條件下，NaHCO3的加入雖然沒有改變發(fā)酵體系中C. crenatum的細胞干質量，卻對葡萄糖消耗速率產生了顯著的影響，結果顯示加入NaHCO3能明顯加快葡萄糖的消耗速率。當NaHCO3濃度為100mmol/L時，葡萄糖的消耗速率達到了69.14mmol/(L·h)，與NaHCO3為0mmol/L時相比增加了130%。然而繼續(xù)增大NaHCO3的濃度，葡萄糖的消耗速率開始略微下降。

表 2 NaHCO3對鈍齒棒桿菌產酸的影響Table 2 Effects of sodium bicarbonate on organic acids production by C. crenatum

乳酸與琥珀酸等有機酸的生成速率和最終產量在加入NaHCO3后也發(fā)生了明顯的變化，而乳酸和琥珀酸的總酸產量一直在1.9mol/mol(表示每消耗1mol葡萄糖所產生的有機酸物質的量)左右，表明消耗的糖都被轉化為乳酸和琥珀酸。由于NaHCO3的加入加快了葡萄糖的消耗速率，有機酸的生成速率也隨之加快。當NaHCO3濃度為100mmol/L時，乳酸的生產速率達到最大，為100.88mmol/(L·h)，是碳酸氫鈉濃度為0mmol/L時的1.86倍。同時，乳酸的積累濃度也達到最大，為400mmol/L，與NaHCO3為0mmol/L時相比升高了84%，而乳酸產量卻由1.84mol/mol下降到1.48mol/mol。繼續(xù)增大碳酸氫鈉的濃度，乳酸的積累濃度開始下降。與乳酸不同的是，隨著NaHCO3濃度的不斷增大，琥珀酸的生產速率也隨之越來越快。當NaHCO3濃度為200mmol/L時，琥珀酸的生產速率達到了30.51mmol/(L·h)。琥珀酸的最終積累濃度為128.05mmol/L，是NaHCO3為0mmol/L時的9.2倍，琥珀酸產量也由0.14mol/mol升高到0.49mol/mol。同時，隨著NaHCO3濃度的不斷增大，發(fā)酵液中產生的琥珀酸與乳酸的物質的量比也在不斷增大，由最初的0.08mol/mol上升到0.34mol/mol。結果表明，向發(fā)酵體系中加入NaHCO3可以調節(jié)乳酸和琥珀酸的產量，增加琥珀酸與乳酸的生成比，為最終實現(xiàn)乳酸與琥珀酸的聯(lián)產奠定了基礎。

表 3 不同NaHCO3濃度下葡萄糖消耗速率與有機酸產生速率Table 3 Glucose consumption rate and organic acids production rate in the presence or absence of sodium bicarbonate

圖 2 NaHCO3對鈍齒棒桿菌產酸的影響Fig.2 Effects of sodium bicarbonate on the yield of organic acids in C. crenatum

2.2 NaHCO3對C. crenatum代謝通量的影響

分析圖1的網絡代謝模型可以看出，C. crenatum主要利用兩條途徑產琥珀酸：C4途徑和乙醛酸循環(huán)。通過代謝流分析，研究在NaHCO3加入后細胞內代謝通量的變化，能更深入的了解2種途徑在琥珀酸合成方面的作用，為進一步提高琥珀酸產量提供更有力的理論依據。

研究發(fā)現(xiàn)，加入NaHCO3能增加琥珀酸的產量。為了探尋NaHCO3改變C. crenatum細胞內碳代謝流分布、增加琥珀酸產量的機理，本實驗分析比較了C. crenatum在NaHCO3濃度為0mmol/L和100mmol/L時代謝通量的變化，并對計算結果進行了歸一化處理，代謝通量數(shù)據單位為mmol/(L·g·h)。由于C. crenatum在厭氧情況下停止了生長，因此在代謝通量計算過程中忽略了生物質的影響。

表 4 不同NaHCO3濃度下關鍵節(jié)點的代謝流變化Table 4 Metabolic flux rate of C. crenatum at key points in the presence or absence of sodium bicarbonate

圖 3 NaHCO3濃度為0mmol/L(a)和100mmol/L(b)時的鈍齒棒桿菌代謝通量分布Fig.3 Metabolic flux distribution in C. crenatum in the presence of 0 mmol/L and 100 mmol/L of sodium bicarbonate

由表4和圖3a、b可知，C. crenatum消耗的葡萄糖主要用于乳酸的生成，其次是琥珀酸。加入NaHCO3后，Glu-6-P節(jié)點處的代謝流分布發(fā)生了較大的變化。戊糖磷酸途徑(HMP)得到了加強，代謝通量由9.7mmol/(L·g·h)增加到35.3mmol/(L·g·h)。理論上每消耗1mol葡萄糖可產生2mol琥珀酸，需要4mol NADH，而每摩爾葡萄糖經由EMP途徑只產生2mol的NADH[15]。NADH的不足限制了C. crenatum利用C4途徑生產琥珀酸。因此，細胞在NADH不足的情況下強化了HMP途徑，使更多的碳源流向HMP途徑，因為每摩爾葡萄糖經HMP途徑后再回到EMP途徑可多產生2mol的NADPH。多產生的NADPH又可以用于生成更多的琥珀酸。

PEP節(jié)點處的碳代謝流也重新進行了分布。由PEP到丙酮酸(Pyr)的碳流量流減少18.9%，而流向草酰乙酸(OoA)的碳流量增加了2倍(表3)，因此，丙酮酸下游代謝物通量(乳酸、乙酸)出現(xiàn)了不同程度的下降，但乳酸仍為主要產物。代謝通量計算結果表明(表4、圖3)，C4途徑在產琥珀酸的過程中起主導作用，經由C4途徑產生的琥珀酸占整個琥珀酸產量的96%。

PEPC是C. crenatum細胞內的主要羧化酶，其催化的反應過程需要CO2的參與。NaHCO3溶于水后會以CO2-HCO3－的形式存在，提高了溶液中的CO2濃度，可以使更多的CO2參與PEPC催化的羧化反應。因此，CO2可利用濃度的高低會直接影響PEPC的酶活。有研究表明，利用Anaerobiospirillum succiniciproducens厭氧發(fā)酵產琥珀酸時，提高發(fā)酵液中CO2的可利用濃度能增強磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PEPCK)的酶活，使更多的碳源流向C4途徑，增加琥珀酸產量[16]。為了驗證是因為NaHCO3的加入而導致PEPC酶活性的提高，進而使PEP節(jié)點處的碳代謝流重新進行了分布，并對PEPC的酶活進行了測定。

由表4可知，加入NaHCO3后，PEPC的酶活力由0.956U/mg升高到1.242U/mg。增強的PEPC酶活可能打破了PEP節(jié)點處的代謝流平衡，并重新分配了此節(jié)點處的代謝流，而將更多的碳代謝流引向C4途徑，從而使細胞分泌更多的琥珀酸。其次，高酶活的PEPC可以將PEP快速地轉化為下游代謝物，減少細胞內的PEP積累量。由于PEP會對磷酸果糖激酶產生反饋抑制，進而影響糖酵解的速率[17]，因此，NaHCO3的加入可以使PEP快速的轉化為下游產物，解除了PEP對對磷酸果糖激酶產生的反饋抑制，使糖酵解能順利的運行下去。

3 結 論

本實驗研究了NaHCO3對C. crenatum厭氧發(fā)酵產琥珀酸的影響，并對代謝流進行了分析。NaHCO3溶解在發(fā)酵體系中可以為PEPC提供羧化反應所需的CO2，因此添加不同濃度的NaHCO3會對PEP節(jié)點代謝流分布產生影響，進而改變胞外代謝產物的積累濃度。加入NaHCO3能加快C. crenatum利用葡萄糖的消耗速率，提高PEPC的酶活，使PEP節(jié)點的碳代謝流分布發(fā)生變化，使更多的碳源流向C4途徑，增加琥珀酸的產量，增加乳酸和琥珀酸的生成比，為利用C. crenatum轉化可再生資源聯(lián)產乳酸和琥珀酸奠定了基礎。下一步將對C. crenatum厭氧發(fā)酵聯(lián)產乳酸和琥珀酸進行發(fā)酵工藝優(yōu)化，循環(huán)利用C. crenatum菌體進行多批次發(fā)酵，提高生成效率，降低生產成本。

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