轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2 定量測(cè)定的不確定度分析

王 東，宋 君，葉先林，雷紹榮，劉文娟，常麗娟，尹 全，張富麗

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川成都610066）

從1993年國(guó)際上發(fā)布《測(cè)量不確定度表示指南》到2012年我國(guó)發(fā)布新版《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF1059.1—2012）超過(guò)10 a里，不確定度理論研究與評(píng)定實(shí)踐在我國(guó)得到了長(zhǎng)足發(fā)展[1-4]。相對(duì)于計(jì)量與校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，不確定度評(píng)估在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用相對(duì)較少，主要原因可能在于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)報(bào)告涉及眾多參數(shù)，測(cè)量不確定度的計(jì)算非常繁瑣等[5]。

轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)是國(guó)際上主流的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法，它通過(guò)測(cè)量指數(shù)時(shí)期擴(kuò)增后的外源DNA數(shù)量，然后根據(jù)數(shù)學(xué)公式計(jì)算出樣品中外源DNA的原始拷貝數(shù)量[6-9]。由于該技術(shù)操作步驟繁多、微量轉(zhuǎn)移液體誤差大、熒光基團(tuán)易降解等原因，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室之間檢測(cè)結(jié)果差異較大。目前，我國(guó)尚未出臺(tái)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品定量標(biāo)識(shí)閾值[10-11]，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有開(kāi)展測(cè)量不確定度評(píng)估工作。近年來(lái)，歐盟的轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室摒棄了靈敏度不高的End Point PCR（終點(diǎn)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）方法，而用靈敏度較高的Quantitative real time PCR（實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物并評(píng)估其測(cè)量不確定度。國(guó)際上轉(zhuǎn)基因生物測(cè)量不確定度評(píng)估，主要采用Top Down或Bottom Up[12]。

本研究采用Bottom Up途徑，參考《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF1059.1—2012）[13]，評(píng)估了樣品中轉(zhuǎn)基因大豆（GTS40-3-2）含量的不確定度，以期為轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室不確定度評(píng)估提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

本試驗(yàn)以含量為100%的轉(zhuǎn)基因大豆（GTS40-3-2）粉末的DNA梯度稀釋液作為制備工作曲線的DNA模板，以含量約為3%的GTS40-3-2混合粉末（轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2粉末與非轉(zhuǎn)基因大豆粉末按照質(zhì)量比為3∶97的比例均勻混合）作為測(cè)試樣品。

1.2 試劑和儀器

植物基因組DNA純化試劑盒和real time PCR Master Mix試劑盒（均購(gòu)自Tiangen生物技術(shù)有限公司（北京）），超微量分光光度計(jì)（Nanodrop1000，Thermo），高速冷凍離心機(jī)（Heraeus，Thermo），7500 Real Time PCR system（Applied Biosystem Incorporation，F(xiàn)oster city,USA）等。

1.3 DNA 提取

稱取100%含量的GTS40-3-2粉末和含量約為3%的GTS40-3-2粉末各100 mg，按植物基因組DNA純化試劑盒（Tiangen生物技術(shù)有限公司，北京）說(shuō)明書(shū)分離、純化DNA。

1.4 引物和探針

根據(jù)《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸定量PCR檢測(cè)方法（GB/T 19495.5—2004）》的附錄A（轉(zhuǎn)基因大豆實(shí)時(shí)熒光PCR方法）[14]中的引物、探針序列合成引物和探針。

1.5 DNA 梯度稀釋和PCR 反應(yīng)體系

將分離純化得到的100%含量的GTS40-3-2粉末的DNA濃度，按照1∶5稀釋成5個(gè)質(zhì)量濃度梯度：100，20，4，0.8，0.16 ng/μL。將含量約為3%的GTS40-3-2粉末的DNA濃度稀釋成50 ng/μL。取3μL上述DNA稀釋液加入到25μL反應(yīng)體系：2×Taqman Master mix 12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，探針（10μmol/L）0.5μL，補(bǔ)水至25μL。每個(gè)DNA濃度稀釋液做3個(gè)平行反應(yīng)，待測(cè)樣品做16個(gè)重復(fù)測(cè)試。在ABI7500型熒光定量PCR儀器上運(yùn)行反應(yīng)程序：95℃變性10 min；95℃15 s，60℃1 min，共40次循環(huán)。

2 測(cè)量結(jié)果與不確定度評(píng)定

根據(jù)實(shí)時(shí)PCR指數(shù)擴(kuò)增期的循環(huán)數(shù)閾值（C t值）與基因含量對(duì)數(shù)值（lg A）之間的數(shù)學(xué)關(guān)系式C t＝m×lg A＋k（A 為內(nèi)源基因（Lectin）或外源基因（GTS40-3-2）的質(zhì)量；C t為儀器檢測(cè)到的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)閾值；k為工作曲線在y軸的截距；m為工作曲線的斜率），以C t值為縱坐標(biāo)，以lg A 值為橫坐標(biāo)，7500 Real Time PCR system儀器自帶軟件自動(dòng)擬合工作曲線，得到內(nèi)、外源基因含量的線性回歸方程。

將所測(cè)樣品外源基因或內(nèi)源基因的C t值代入各自的回歸方程，計(jì)算出樣品中內(nèi)源基因或外源基因的質(zhì)量（或拷貝數(shù)）。再根據(jù)公式C＝A外/A內(nèi)×100%（C 為樣品中轉(zhuǎn)基因成分的百分含量（%）；A外為樣品中外源基因的質(zhì)量；A內(nèi)為樣品中內(nèi)源基因的質(zhì)量），計(jì)算出樣品中轉(zhuǎn)基因成分的百分含量。

2.1 檢測(cè)結(jié)果

將GTS40-3-2含量約為3%的測(cè)試樣品，進(jìn)行16次重復(fù)測(cè)定，結(jié)果列于表1。

表1 測(cè)試樣品中GTS40-3-2 含量測(cè)定結(jié)果

2.2 內(nèi)、外源基因工作曲線的制備

lectin內(nèi)源基因和GTS40-3-2轉(zhuǎn)化事件片段的工作曲線，由ABI7500 software 2.0軟件自動(dòng)擬合（表2，3）。lectin內(nèi)源基因工作曲線的回歸方程為y＝-3.414x＋31.604，相關(guān)系數(shù)R2＝0.996；GTS40-3-2轉(zhuǎn)化事件片段工作曲線的回歸方程為y＝-3.457x＋29.732，相關(guān)系數(shù)R2＝0.997。

表2 內(nèi)源基因lectin 工作曲線擬合

表3 GTS40-3-2 工作曲線擬合

2.3 不確定度來(lái)源

轉(zhuǎn)基因生物測(cè)量的不確定度來(lái)源主要有探針標(biāo)記熒光基團(tuán)分解、儀器穩(wěn)定性、基因擴(kuò)增效率偏差等隨機(jī)效應(yīng)。此外，試驗(yàn)中微量液體轉(zhuǎn)移、移液器定值偏差、內(nèi)外源基因含量與熒光信號(hào)（C t值表示）的非線性偏離等都是基因定量分析結(jié)果的不確定度主要來(lái)源[15]。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)不確定評(píng)定

2.4.1 A類標(biāo)準(zhǔn)不確定評(píng)定 A類不確定度由各類隨機(jī)效應(yīng)引起，按照Bessel公式計(jì)算：

式中，xi為GTS40-3-2每次相對(duì)含量測(cè)量結(jié)果值；x 為16次重復(fù)測(cè)量GTS40-3-2相對(duì)含量的平均值；n 為測(cè)量次數(shù)。

2.4.2 B類標(biāo)準(zhǔn)不確定評(píng)定

2.4.2.1 工作曲線讀數(shù)C t值的不確定度 與lg A外對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值C t外對(duì)GTS40-3-2工作曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)差，即回歸標(biāo)準(zhǔn)差，按照以下公式計(jì)算：

在試樣的測(cè)量次數(shù)p＝16時(shí)，最小二乘法引入的不確定度分量為：

u（A外）＝10lgA外×ln10×u（lg A）；

u（A外）＝A外×2.303×u（lg A）。

故其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urelA外＝u（A外）/A外＝2.303×0.010＝0.023。

同理，與lg A內(nèi)對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值C t內(nèi)對(duì)內(nèi)源基因lectin工作曲線擬合的回歸標(biāo)準(zhǔn)差為：

內(nèi)源基因工作曲線的不確定度u（C t內(nèi)）分量為：

u（A內(nèi)）＝10lgA內(nèi)×ln10×u（lg A內(nèi)）；

u（A內(nèi)）＝A內(nèi)×2.303×u（lg A內(nèi)）。

故其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urelA內(nèi)＝u（A內(nèi)）/A內(nèi)＝2.303×0.016＝0.037。

按照統(tǒng)計(jì)原理計(jì)算得到工作曲線的不確定度，其自由度為n-2。故，νA外＝n-2＝15-2＝13；νA內(nèi)＝n-2＝15-2＝13。

不同量程的移液器在加樣過(guò)程中具有測(cè)量的獨(dú)立性，因此，微量移液器允差帶來(lái)的合成相對(duì)不確定度為：

2.4.2.3 B類標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成 B類不確定度各分量urel外，urel內(nèi)，urel移液器彼此獨(dú)立，其靈敏系數(shù)都為1，3個(gè)合成為B類標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3 合成不確定度u rel

因?yàn)锳類標(biāo)準(zhǔn)不確定度和B類標(biāo)準(zhǔn)不確定度彼此獨(dú)立，故：

4 擴(kuò)展不確定度U

U＝k×uc，包含因子k 為置信水準(zhǔn)（P）95%，自由度νeff為198的t 分布臨界值，按非整ν 內(nèi)插計(jì)k為1.96，故U＝1.96×0.002＝0.016≈0.02。

所以，測(cè)量結(jié)果C＝0.028±0.02。

5 討論

測(cè)量不確定度是衡量實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量的重要尺度，一般來(lái)說(shuō)不確定度越小，檢測(cè)結(jié)果與約定真值越靠近，檢測(cè)質(zhì)量越高；但不確定度過(guò)小，在實(shí)驗(yàn)室間的數(shù)據(jù)比對(duì)時(shí)，往往造成比對(duì)數(shù)據(jù)離群[5]。被測(cè)量的不確定度取決于各輸入量的不確定度，在評(píng)估測(cè)量結(jié)果的不確定度時(shí)，應(yīng)先評(píng)定各分量的不確定度。本研究用Bessel公式估算16次重復(fù)測(cè)量GTS40-3-2含量結(jié)果的A類不確定度（uA＝0.000 8）。由于轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)體系一般是微量體系（50μL以內(nèi)），移液誤差對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大；此外，數(shù)據(jù)對(duì)之間的非線性偏離會(huì)影響工作曲線的擬合。在B類不確定評(píng)估中，重點(diǎn)估算了內(nèi)源基因（Lectin）、外源基因（GTS40-3-2）工作曲線的不確定度（urelA內(nèi)＝0.037，urelA外＝0.023）以及反應(yīng)體系（25μL）制備中微量液體轉(zhuǎn)移的不確定度（urel移液器＝0.07）。在此基礎(chǔ)上，計(jì)算出合成了所有分量不確定度的合成不確定度（uC＝0.002）。在95%的置信水平下（νeff＝198，k＝1.96），計(jì)算出擴(kuò)展不確定度（U＝0.02）。測(cè)量結(jié)果（C＝0.028±0.02）接近約定真值（0.03），測(cè)量不確定相對(duì)較小，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2檢測(cè)質(zhì)量較高。

從各分量的不確定度看，微量液體轉(zhuǎn)移引入的不確定度最大（0.07）。因此，在今后的測(cè)試中應(yīng)重點(diǎn)注意微量液體轉(zhuǎn)移量的準(zhǔn)確性，尤其應(yīng)重視移液器的校準(zhǔn)。在實(shí)驗(yàn)操作中，應(yīng)選用與移液器匹配較好、液體低吸附（low binding）的槍頭，盡量降低移液器帶來(lái)的不確定度。在轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)過(guò)程中，不同環(huán)節(jié)都可能產(chǎn)生不確定度[16]，如送樣種子顆粒數(shù)量與期望含量、樣品縮分、DNA分離及其濃度測(cè)量、DNA溶液稀釋、反應(yīng)體系制備、熒光基團(tuán)降解、工作曲線擬合等。本研究重點(diǎn)討論了轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)中微量液體的轉(zhuǎn)移和工作曲線引入的不確定度，是對(duì)轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)結(jié)果不確定度評(píng)定的初步嘗試，而在實(shí)際測(cè)試中，應(yīng)盡可能多地對(duì)從制樣到數(shù)據(jù)分析等各個(gè)環(huán)節(jié)的不確定度進(jìn)行評(píng)估，從而獲得較準(zhǔn)確的測(cè)量不確定度。

［1］Wang CX，Shu Y.Evaluationon uncertainty of determining aspartamein beverage by HPLC[J].Agricultural Science&Technology，2009，10（5）：6-8.

［2］張涵信，查俊.關(guān)于CFD驗(yàn)證確認(rèn)中的不確定度和真值估算[J].空氣動(dòng)力學(xué)學(xué)報(bào)，2010，28（1）：39-45.

［3］王小鵬，高志山，馬駿，等.非球面測(cè)量中零位計(jì)算全息的測(cè)量不確定度分析研究[J].光學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（1）：1-5.

［4］劉文彬，居漪.常規(guī)化學(xué)項(xiàng)目總誤差和不確定度比較研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，27（12）：1002-1006.

［5］林瑞波.檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室參數(shù)測(cè)量不確定度評(píng)定淺析[J].中國(guó)計(jì)量，2011（8）：71-73.

［6］宋勇濤，王勇，劉勤，等.FQ-PCR在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展，2008，29（11）：55-59.

［7］馬燕斌，吳霞，蔡永峰，等.TaNHX1 基因的組織特異性表達(dá)及生物信息學(xué)分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（5）：422-426.

［8］田義軻，李節(jié)法，王彩虹，等.梨莖尖中PpKO 基因表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2012，27（3）：62-66.

［9］王渭霞，賴?guó)P香，洪利英，等.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)插入拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)基因含量[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，20（1）：9-15.

［10］劉信，宋貴文，沈平，等.國(guó)外轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)技術(shù)及其標(biāo)準(zhǔn)化研究綜述[J].農(nóng)業(yè)科技管理，2007，26（4）：3-7.

［11］厲建萌，宋貴文，劉信，等.淺談轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品閾值管理[J].農(nóng)業(yè)科技管理，2009，28（3）：29-32.

［12］ Jana Zel，Kristina Gruden，Katarina Cankar，et al.Calculation of measurement uncertainty in quantitative qnalysis of genetically modified organisms using intermediate precision-A practical approach[J].Journal of AOACInternational，2007，90（2）：582-586.

［13］國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.JJF1059.1—2012 測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[S].北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2012.

［14］中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T19495.5—2004 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸定量PCR檢測(cè)方法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

［15］宋君，雷紹榮，劉勇，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MON863結(jié)構(gòu)特異基因的測(cè)量不確定度[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（33）：20312-20315.

［16］宋君，雷紹榮，郭靈安，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MON863的測(cè)量不確定度分析[J].玉米科學(xué)，2012，20（5）：45-49.